固相萃取离子色谱法快速测定烟草中钾、钠、钙、镁和氨的研究

采用带固相萃取净化功能的样品萃取瓶超声萃取烟草样品,样品萃取液用石墨化炭黑球固相萃取净化。然后以IonPacCS12A阳离子交换色谱柱(3 ′ 150 mm,5 μm)为固定相,30 mM甲基磺酸为流动相,淋洗液流速1.0 mL/min,K+、Na+、Mg2+、Ca2+、和NH4+ 5种阳离子在6.0 min内可达到完全分离。采用自主设计的样品萃取瓶,可不经样品转移就完成样品的萃取、净化和过滤。和常规方法相比,操作流程得到简化,效率大幅度提高,灵敏度和回收率高、精密度好。为基因编辑素材钾、钠、钙、镁和氨的快速测定提供了高通量分析方法。     

织锦巴非蛤形态性状对体质量的影响

猪在农业和医学领域均具有重要应用价值,利用基因修饰技术能够快速提高猪的经济性状和培育 人类疾病动物模型。CRISPR/Cas9 基因编辑技术具有操作简单、高效和低成本的优势,在猪基因修饰领域具有重 要应用。但 CRISPR/Cas9 易引发基因组结构不稳、大范围染色体重排和基因脱靶等问题,因而具有潜在的生物 安全风险。近年基于 CRISPR/Cas9 开发的碱基编辑技术可以实现单个碱基定向转换,不会导致 DNA 双链断裂, 理论上不会引发插入 / 缺失（Indels）,对基因编辑更精准、更安全。随着碱基编辑工具的不断开发和改良,其 不仅能产生 C → T（A → G）突变,还能产生 C、A 两种碱基的同时突变以及 C → G 突变,增加了应用范围;改 良的碱基编辑工具在保持编辑效率的同时能够降低甚至消除旁侧突变、非 C → T（A → G）突变以及 Indels,使 得碱基编辑技术在猪遗传修饰上具有更加重要的潜在应用价值。综述了不同的碱基编辑系统原理、碱基编辑技 术在基因修饰猪模型构建和猪遗传改良中的应用,以及碱基编辑系统在猪成纤维细胞中的编辑效率和脱靶情况, 以期为开展猪碱基编辑应用实践提供参考。     

基因组学与蛋白质组学课程教学实践与体会

从构建完整的教学内容、灵活运用多种教学方法两方面探讨了基因组学与蛋白质学课程的教学改革。教学内容改革包括教材的合理选用、"宽口径、厚基础、重能力"教学内容的改革、教学内容的优化与更新,多种教学方法的运用包括多媒体与板书相结合、案例教学法、录像教学法、启发式教学法、网络教学法。     

CRISPER/Cas9系统在植物基因组定点修饰及作物遗传育种中的应用研究进展

CRISPR/Cas9系统是一项简单、高效的基因定点编辑技术,在植物遗传改良及作物良种选育等方面具有重要的应用价值。本研究主要介绍了CRISPR/Cas9的原理及构建方法,论述了近年来CRISPR/Cas9技术在植物基因功能及基因表达调控、植物基因组的定向编辑以及作物分子育种中的应用及研究进展,分析了该基因编辑系统的主要影响因素及优化改进方式,探讨了该系统在应用中的问题及解决途径并对今后发展方向进行了展望,为该技术在植物基因组定点编辑及作物遗传育种等领域研究提供参考。     

Improvements of TKC Technology Accelerate Isolation of Transgene-Free CRISPR/Cas9-Edited Rice Plants

Elimination of the CRISPR/Cas9 constructs in edited plants is a prerequisite for assessing genetic stability, conducting phenotypic characterization, and applying for commercialization of the plants. However, removal of the CRISPR/Cas9 transgenes by genetic segregation and by backcross is laborious and time consuming. We previously reported the development of the transgene killer CRISPR (TKC) technology that uses a pair of suicide genes to trigger self-elimination of the transgenes without compromising gene editing efficiency. The TKC technology enables isolation of transgene-free CRISPR-edited plants within a single generation, greatly accelerating crop improvements. Here, we presented two new TKC vectors that show great efficiency in both editing the target gene and in undergoing self-elimination of the transgenes. The new vectors replaced the CaMV35S promoter used in our previous TKC vector with two rice promoters to drive one of the suicide genes, providing advantages over our previous TKC vector under certain conditions. The vectors reported here offered more options and flexibility to conduct gene editing experiments in rice.     

茶树咖啡碱合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建

CRISPR/Cas9技术是一门新兴的基因组定点编辑技术,具有操作简单、高效的优点,可轻松实现对目标基因的敲除、替换和定点突变等操作。该技术刚诞生,就受到了全球生命科学领域研究者的关注,不到3年的时间就已经成功应用于多种动、植物当中。然而CRISPR/Cas9技术在茶树中的应用面临载体构建问题,本文以茶树咖啡碱合成酶为例,联合采用常规PCR、Overlapping PCR和Golden Gate Cloning技术,构建了包含茶树咖啡碱合成酶双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,为CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础。     

Bacteriophage OP1, lytic for Xanthomonas oryzae pv. oryzae, changes its host range by duplication and deletion of the small domain in the deduced tail fiber gene

The entire genome of bacteriophage OP₁, lytic for Xanthomonas oryzae pv. oryzae causing bacterial leaf blight of rice, and the partial genomes of related phages were sequenced and analyzed. The OP₁ genome comprises double-stranded, 4785-bp long DNA with 51.1% G + C content. Fifty-nine open reading frames (ORFs) were detected. ORF25 had similarity with the tail fiber gene of phages, whose product is related to host specificity. The ORF25 regions were amplified from four host-range mutants (OP_1h, OP_1hC, OP_1h2, and OP_1h2C) by polymerase chain reaction, and their deduced amino acid sequences were compared. Three mutants (OP_1hC, OP_1h2, OP_1h2C) had duplications of a small domain in the N-terminal portion, although there were slight differences in the position of the duplicated sequences. One mutant OP_1h had substituted amino acids in the duplication region. New mutants isolated in the laboratory (OP_1hC and OP_1h2C from OP₁ and OP_1h2) acquired the ability to lyse strain N5874 belonging to phagovar (lysotype) C. However, they rapidly lost this lytic ability when incubated with other phagovars. This loss was always accompanied by a loss of the characteristic repeats, suggesting that the host range of OP₁-related phages changed mainly through duplication and deletion of a small domain in ORF25. The nucleotide sequence data reported are available in the DDBJ/EMBL/GenBank databases under the accession numbers AP008979, AB214312 to AB214316     

多酚氧化酶基因NtPPOE差异表达的效应分析

为研究烟草中多酚氧化酶基因的功能,本研究从GenBank中挑选一个烟草多酚氧化酶基因Polyphenol oxidase E(基因登录号:NW_015916967.1),命名为NtPPOE.构建NtPPOE基因的CRISPR载体和超表达载体,分别得到NtPPOE基因抑制/过量表达的转化植株.研究表明,基因敲除植株NtP...     

利用CRISPR/Cas9技术编辑BADH2-1/BADH2-2创制香米味道玉米新种质

【目的】香味是作物的重要食味品质之一。2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline,2-AP）是主要香味物。BADH2是控制水稻等作物香味性状的关键基因,敲除该基因可以产生香味稻米。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在北京市农林科学院自育的玉米骨干亲本京724上敲除BADH2同源基因,以期获得有香米味道的玉米新种质材料。【方法】利用Ensembl数据库在线BLAST工具,将水稻OsBADH2蛋白序列在拟南芥、水稻和玉米蛋白序列数据库中进行序列比对,获得上述3个物种的BADH基因家族成员,并利用UniProt蛋白数据库中的结构域信息进行验证。进一步使用MEGA软件进行系统进化分析,获得玉米BADH2同源基因作为候选编辑靶标。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理,在候选基因的外显子处设计特异性靶点,并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体。再以玉米自交系京724为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,通过磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase,PMI）抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在靶基因中产生的突变类型。利用气相色谱质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）检测基因编辑株系T₁籽粒中香米主要香味物质2-AP的含量,以确认京724在基因编辑前后2-AP含量的变化。【结果】系统进化分析发现,玉米中存在2个BADH2同源基因,分别命名为ZmBADH2-1和ZmBADH2-2。ZmBADH2-1位于第4染色体,ZmBADH2-2位于第1染色体。2个基因均包含15个外显子和14个内含子,第4外显子间的核苷酸序列高度同源。在2个基因的第4外显子区域设计靶点并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过遗传转化获得28株转基因株系。PCR扩增及测序分析结果显示,其中10株材料的2个ZmBADH2s在靶点区域均发生突变,突变基因型包括双等位突变和多等位突变,突变类型为不同数量的碱基缺失和插入。质谱检测结果显示玉米ZmBADH2双基因突变体籽粒中存在与香稻同样成分的2-AP。随机选取的4个T₁代基因编辑株系籽粒中,2-AP平均含量分别为438.29、404.63、348.65和161.82 μg·kg^-1,而未经过编辑的京724中未检测到2-AP。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对玉米ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同时进行定点敲除,创制出籽粒中具有香米味道的玉米骨干亲本新种质材料。