Constructing the barley model for genetic transformation in Triticeae

Barley(Hordeum vulgare L.) is one of the oldest domesticated crops, showing dramatic adaptation to various climate and environmental conditions. As a major cereal crop, barley ranks the 4th after wheat, maize and rice in terms of planting area and production all over the world. Due to its diploid nature, the cultivated barley is considered as an ideal model to study the polyploid wheat and other Triticeae species. Here, we reviewed the development, optimization, and application of transgenic approaches in barley. The most efficient and robust genetic transformation has been built on the Agrobacterium-mediated transfer in conjunction with the immature embryo-based regeneration. We then discussed future considerations of using more practical technologies in barley transformation, such as the T-DNA/transposon tagging and the genome editing. As a cereal crop amenable to genetic transformation, barley will serve as the most valuable carrier for global functional genomics in Triticeae and is becoming the most practical model for generating value-added products.     

农杆菌介导遗传转化获得转CP4基因籼稻的研究

  目的  建立籼稻‘中恢161’Oryza sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的转化体系。  方法  以籼稻‘中恢161’的成熟胚为材料,设置了5个草甘膦质量浓度(100、200、300、400和500 mg·L?1)进行胚性愈伤组织的草甘膦敏感性试验。利用农杆菌介导法,将草甘膦抗性基因CP4-EPSPS导入‘中恢161’的胚性愈伤组织中,转化后的胚性愈伤组织分别在含有300、350和400 mg·L?1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选。抗性愈伤组织进一步分化、成苗。  结果  草甘膦质量浓度为300~400 mg·L?1时,愈伤组织褐化率约50%,具有很好的选择效果。经统计,300、350和400 mg·L?1草甘膦抗性筛选后,愈伤组织阳性率分别为40.16%、61.72%和84.04%,抗性愈伤组织的分化率为46.43%,成苗率为32.84%。共获得67株再生小苗,经PCR检测,43株成功转入CP4基因,再生植株阳性率为64.18%。  结论  建立了‘中恢161’农杆菌介导的转化体系。图5参20     

蝴蝶兰·文心兰遗传转化体系的初步研究

[目的]优化蝴蝶兰和文心兰的遗传转化条件。[方法]以培养3周的蝴蝶兰原球茎和文心兰愈伤组织为试材,以大肠杆菌为生长培养基,研究3种农杆菌菌株的侵染力,以及菌液浓度、侵染时间、酚类诱导物(AS)和共培养时间对转化的影响。[结果]以蝴蝶兰原球茎为农杆菌介导的外植体进行遗传转化的优化条件为:预培养时间3d,菌液侵染浓度OD600=0.3,菌液侵染时间10min,pH值5.4,菌液侵染后,与农杆菌共培养5d并添加100μmol/LAS,此条件下的瞬间表达率最高。将蝴蝶兰遗传转化的条件运用于文心兰,得到的转化率较低。3种农杆菌菌株中,EHA105菌株侵染力最强,其次是AGL1,LBA4404最弱。[结论]该研究为进一步研究蝴蝶兰和文心兰的遗传转化体系提供理论依据。     

转大豆铁结合蛋白基因水稻的初步研究

采用冻融法将含有大豆铁结合基因的质粒pGTV-35S-fer转入农杆菌菌株LBA4404中,以宁夏4个水稻主栽品种为受体材料,通过农杆菌介导法转化水稻愈伤组织,经2轮次除草剂筛选获得了再生植株。经过对转化植株的PCR扩增检测,证明外源大豆铁结合基因已经转入宁夏水稻植株中。大豆铁结合蛋白基因在水稻种子中特异表达,转基因植株种子中的铁含量是未转化植株的1.7~2.2倍。     

利用农杆菌介导法转化泗棉3号的研究

泗棉3号农艺性状优良,是20世纪90年代长江流域棉区的主栽品种,利用基因工程导入外源基因进行直接改良,可以迅速获得新的品种或育种材料。以陆地棉泗棉3号的下胚轴为外植体,建立了高效的转化体系,得到了大量的转基因植株。泗棉3号的出愈率和分化率显著高于模式品种Coker 312,同时它出现分化中心的主要形态不同于Coker 312,其胚性愈伤组织主要来源于两类初生愈伤组织。对泗棉3号的胚性愈伤组织进行GUS检测,以及对再生植株叶片进行PCR检测后,阳性植株嫁接于温室。在温室用2 063.98 μmol L^-1的卡那霉素点涂叶片检测nptⅡ基因的表达和取叶片进行gus基因的组织化学检测,同时通过Southern blot分析检测,证明目的基因成功地整合到泗棉3号基因组中。     

农杆菌介导的pac1基因转化大豆研究

选用高感大豆花叶病毒病而再生能力较强的大豆品种和品系作为受体,对丛生芽诱导培养基、侵染菌液的制备以及根的诱导方法进行了优化。采用优化后的遗传转化体系以农杆菌介导法将pac1导入大豆,MSB培养基中附加2 mg/L6-BA+0.2 mg/LIBA进行丛生芽诱导,液体YEB重悬活化菌体后侵染,MSB培养基中蔗糖含量15%+2 mg/LIBA+0.2 mg/L6-BA进行生根诱导。共获得8株PCR检测呈阳性植株,经SouthernBlot检测,证明pac1基因已整合到大豆基因组中。转基因植株对病毒的抗性评价正在进行中。     

农杆菌介导法向小麦茎尖导入DREB1A基因的研究初报

为了研究以小麦茎尖为受体进行农杆菌转化的可行性,选用小麦品种H6756,以茎尖为受体进行了农杆菌转化.构建了含有拟南芥逆境诱导转录因子DREB1A及除草剂bar基因的表达载体pC3300IS-DREB1A,酶切鉴定此载体,结果证明其连接完全正确,具有转录和表达的功能.农杆菌介导法向小麦茎尖导入DREB1A基因,共获得247株转化苗.转化苗经除草剂筛选,获得66株抗性苗,对抗性苗进一步进行PCR检测,有30株抗性苗扩增出特异性片段,转化率达到12.1%,初步说明本试验中以小麦茎尖为受体的转化系统用于基因转化是可行、高效的.     

农杆菌介导AVP1基因转化甜菜

甜菜是我国重要的糖料作物之一.为了提高甜菜含糖量和产量,增强其抗逆性,本研究应用植物基因工程手段对甜菜进行遗传改良.实验以甜菜DF1031品系为受体材料,利用农杆菌介导法将AVP1基因转入甜菜子叶节,获得转基因植株.研究了菌液侵染浓度、侵染时间、共培养时间、抗生素羧苄青霉素(Carb)、头孢霉素(Cef)以及筛选剂卡那...     

一个含LoxP-FRT重组酶位点及易于操作的植物表达双元载体pYBA100

在农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的植物遗传转化中,常常需要用到植物表达双元载体。为便于基因工程操作并能在获得转基因植物后方便将标记基因删除,我们构建了植物表达双元载体pYBA100,以满足用于生产安全转基因植物的需要。本研究通过融合PCR方法,尽可能去除所有非必需的序列,将pYBA载体最小化。pYBA载体在大肠杆菌中为多拷贝,骨架为3.69kb。我们构建的含NptⅡ植物筛选标记基因的载体pYBA100仅为5.37kb,多克隆位点为22个,方便基因工程操作。载体pYBA100的T-DNA植物筛选基因表达框两侧预留有LoxP-FRT融合位点,方便在获得转基因植物后通过Cre或FLP重组酶将植物筛选标记基因删除。pYBA100载体能于大肠杆菌和农杆菌中自我复制,并成功转化了拟南芥,符合农杆菌介导的植物转基因要求。离体删除实验结果证明,载体pYBA100能经Cre重组酶删除植物标记基因表达框。     

农杆菌介导甜橙遗传转化的初步研究

为改良柑桔品种，以普通溆浦甜橙（Citrussinensiscv Xupu）实生苗上胚轴为外植体，建立了农杆菌介导的遗传转化体系，并把chit42基因和phyB基因导入其中．上胚轴经农杆菌工程菌液浸染后，在共培培养基（MS＋3mg／LBA）上培养3d，然后分别转移到含有100mg／L Kan（卡那霉素，Kanamycin）和500mg／L Cef（头孢噻肟霉素，Cefotaxime）的选择培养基上培养14d后，上胚轴开始分化抗性芽，chit42基因和phyB基因的抗性芽再生率分别为27．8％和35．6％．将抗性芽在筛选培养基上培养30d后用茎尖微芽嫁接成苗．目前，嫁接苗在温室中生长良好，经PCR鉴定为转化植株．