连续回交对消除农杆菌介导转化引起水稻体细胞变异的影响

农杆菌介导的转化引起许多体细胞变异, 影响了转基因植物的农艺性状。因此, 转基因作物的培育需要大量的T₀代再生植株。在本研究中, 我们将转基因水稻株系与原始品种连续回交, 然后评价其回交后代的表现, 消除体细胞变异, 恢复转基因亲本的农艺性状。回交的供体亲本是3个转基因水稻株系, 分别带有来自于苏云金芽胞杆菌(Bt)的抗虫基因。与原始品种连续回交至BC₃F₁代, 每代BC_nF₁单株再自交两代, 同时对各个世代进行抗虫性选择。通过发芽试验获得转基因纯合的BC_nF₃株系, 在室内抗性试验中, 所有的BC_nF₃纯合株系都能杀死100%的幼虫。在田间试验中, 这些株系的单株产量明显高于供体亲本, 大部分农艺性状与原品种没有显著的差异。这些结果说明连续回交能够在很大程度上恢复转基因水稻株系的农艺性状, 从而减少转基因育种过程中所需的工作量。     

农杆菌介导的水稻草矮病毒NS6基因的转化

水稻草矮病毒(Ricegrassystuntvirus,RGSV)RNA6片段毒义链编码的非结构蛋白NS6,与病害症状密切相关,被称为病害特异蛋白.因此,应用农杆菌介导法,选取对RGSV表现不同抗性的台农67、中花6号、中花12号、中花15号、台中1号、合系28和063817个水稻品种,以其未成熟胚或成熟胚预培养4d后,诱导生长旺盛的愈伤组织为外植体,将NS6基因导入其中,对影响水稻再生及农杆菌转化的主要因素进行了比较研究,并获得了转NS6基因工程植株.结果表明,以未成熟胚为受体,获得的抗性愈伤组织转化率明显高于成熟胚;水稻不同品种对农杆菌转化反应不同;添加一定浓度乙酰丁香酮和葡萄糖,可提高抗性愈伤组织形成率;选用G418进行抗性筛选能获得转NS6基因再生植株,用卡那霉素筛选产生的愈伤组织则未能获得再生植株.     

农杆菌介导转化石斛兰—蝴蝶兰杂交种类原球茎体的研究

以类原球茎体为受体材料,利用农杆菌EHA101(pIG121 Hm)介导转移GUS基因到石斛兰-蝴蝶兰的2个杂交品种。以一种β-内酰胺类新型抗生素美罗培南(Meropenem)作为抑菌抗生素和以潮霉素为筛选元件进行选择,获得了潮霉素抗性体,并通过X-gluc组织化学染色法,检测到较强的GUS的表达,表达率达80%以上。经过80 d的选择培养后在81个潮霉素抗性组织中获得了22株再生兰花。对其中的9株PCR阳性的再生植株进行Northern分析,检测到较强的GUS基因表达。     

海滨雀稗以hpt与bar基因为筛选标记的转化体系比较研究

海滨雀稗作为耐盐性较强的暖季型草坪草,具有极大的应用潜力。为建立高效稳定的海滨雀稗遗传转化体系,本研究以海滨雀稗成熟种子为外植体,确定了筛选剂潮霉素和草丁膦在海滨雀稗的愈伤组织继代培养和再生阶段的最佳筛选压。在进一步优化遗传转化条件的基础上,比较了以hpt与bar基因作为转基因筛选标记对海滨雀稗农杆菌介导的遗传转化效率的影响。结果表明：愈伤组织的再生率在继代36周后显著下降,继代48周的最高再生率为67.9%。潮霉素的最佳筛选压在继代培养阶段为120 mg·L^-1,再生阶段为80 mg·L^-1。草丁膦的最佳筛选压均为1.2 mg·L^-1。选取继代24周的愈伤组织用于农杆菌介导的遗传转化,最佳的转化条件为菌液浓度OD600=0.6,添加100μmol·L^-1乙酰丁香酮和0.01%的Silwet L-77,并辅以超声波处理20 min或真空处理10 min,浸染30min后共培养2 d。通过多次抗性愈伤组织和抗性再生苗的筛选,2种载体均获得了转基因再生植株。通过PCR检测证明hpt和bar基因分别成功在...     

南丰蜜橘胚性愈伤组织诱导及其转化研究

摘要∶南丰蜜橘是原产于中国的古老柑橘品种,其果实皮薄而肉甜,深受消费者喜爱,当前南丰蜜橘的品质发生劣变,影响了其商品价值。为采用基因工程育种以改善南丰蜜橘品质,通过诱导其愈伤组织并以其为试材进行了转基因研究。南丰蜜橘自种子实生苗下胚轴处长产生出愈伤组织,挑选胚性愈伤组织进行增殖后,采用根癌农杆菌介导法进行开花相关基因AP1的转化。结果获得22团抗性愈伤组织,平均产出率为7.3团/皿,表明该品种有较高的转化率。抗性愈伤组织经PCR分析、Southern blot检测证实为转化子。本研究结果表明南丰蜜橘胚性愈伤组织是基因工程改良的良好受体,可用于其它基因的转化研究。     

利用农杆菌介导法将查尔酮合酶基因导入大岩桐

本项研究通过植物基因工程技术,以改变花色为目的,对花卉进行遗传改良,以期产生新的花色品种,来改变现有花卉花色单一、品种缺乏的现状,丰富我市花卉品种资源。在应用转基因技术进行定向改良花色的研究中用的最多也最成功的基因就是:查尔酮合酶基因。查尔酮合酶(Chalconesynthase,CHS)是花色素合成途径中的一个关键酶,它在植物中表达的量可能影响花的颜色。本项目以查尔酮合酶(Chalconesyn-thase,CHS)基因作为目的基因,以大岩桐为研究对象。具体从矮牵牛(Petuniahybrida)特定发育阶段的花瓣的cDNA中,克隆到查尔酮合酶基因CHSA,进行质粒的重组后,插入到含有花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子的植物中间表达载体中pBI121中,转化农杆菌LBA4404。通过农杆菌介导法(之叶盘法)遗传转化大岩桐,具体过程如下:农杆菌LBA4404pBI121chsA的培养→农杆菌与大岩桐叶盘共培养→脱菌筛选→抗性芽的扩繁与继代培养→抗性株的生根筛选→移栽成活。经过研究,成功地得到大岩桐转化植株,其中8个株系的转基因植株经PCR检测呈阳性,证明外源基因已整合进入受体植物。有一株玫红品系植株的花瓣上出现了白色的不规则斑点。     

农杆菌介导小麦遗传转化条件的优化

本研究以普通小麦品种扬麦15和Alondra's的幼胚产生的愈伤组织为受体材料,通过检测gus基因的瞬时表达情况,研究了农杆菌介导的主要影响因子的转化效率。研究结果表明,在相同条件下两个品种农杆菌侵染的最佳条件不尽相同。扬麦15的最佳优化条件为:先在不添加AS的培养基中预培养,然后在菌液浓度为OD600=0.2、AS浓度为100μmol/L条件下侵染10min,最后在25℃共培养1d;Alondra's则在菌液浓度为OD600=0.5、共培养时间为2d时,表现出最佳的gus基因瞬时表达率。为小麦的遗传转化提供参考。     

柑橘黄化花叶病毒侵染性克隆构建及应用

【目的】构建柑橘黄化花叶病毒（citrus yellow mosaic virus,CYMV）侵染性克隆,为深入研究其分子特性及致病机理打下基础。【方法】利用In-Fusion同源重组技术将分段扩增的CYMV基因组序列与三元表达载体pCY重组连接,构建该病毒1.4倍基因组全长DNA克隆并开展序列分析。将所获克隆通过农杆菌介导接种尤力克柠檬实生苗,通过分子检测、症状和病毒粒子观察及再嫁接实验鉴定其侵染性。利用所获侵染性克隆接种不同的柑橘品种及草本植物,通过RT-PCR检测确定侵染率,观察不同柑橘品种受侵染后的症状差异。基于侵染性克隆构建ORFⅠ和ORFⅡ分别替换为绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein,gfp）的突变体,分析突变对病毒侵染性的影响。【结果】利用In-Fusion同源重组技术获得CYMV 1.4倍基因组全长DNA克隆7个。其中,CYMV-3与已登录GenBank的9个CYMV分离株基因组相应核苷酸序列一致性为90%—100%,与分离株CYMV-SO(AF347695)同源性最高并在遗传进化树上聚为一簇。侵染性鉴定结果表明,CYMV-3接种的14...     

农杆菌介导的转ICE1基因提高水稻的耐寒性

利用农杆菌介导的转基因技术,成功地将通过RT PCR克隆的拟南芥ICE1基因导入垦鉴稻10号中,经PCR和Southern检测确认目的基因已整合到水稻基因组中。潮霉素抗性测定结果表明,与未转基因水稻相比,T1代表现出对潮霉素较高的抗性和孟德尔式的单位点遗传。抗寒能力检测结果表明,在同等低温胁迫条件下T1代转基因株系的死亡率明显低于未转基因对照。脯氨酸含量增幅明显高于未转基因对照。上述结果表明,转ICE1水稻提高了抗寒能力。     

基因瞬时表达技术在园艺植物上的应用研究进展

基因瞬时表达技术是近年来发展形成的一种快速高效的基因功能分析方法,应用广泛.本文综述了基因瞬时表达技术的原理、影响因素及其在园艺植物上的应用,指出该技术在当前应用中存在的不足并提出建议及展望.