甘薯SAAT法遗传转化条件的优化

SAAT即声波辅助的农杆菌遗传转化方法。在遗传转化中,超声波处理可以在外植体上产生许多易于农杆菌进入的微小伤口和通道,从而提高转化率。该研究首次将SAAT法应用于甘薯遗传转化并对遗传转化体系进行优化,根癌农杆菌菌株为EHA101/pROA93(nptⅡ和gus),受体材料为甘薯品种栗子香的胚性悬浮细胞。结果表明,悬浮培养105 d,继代培养3 d,将经超声波处理30 s的胚性悬浮细胞侵染到OD600值稀释至0.5的对数生长期的EHA101菌液中10 m in,经4 d共培养后,GUS瞬时表达率最高,达到86.7%,稳定表达率为37.9%;转化时加入乙酰丁香酮亦能提高转化率;转基因植株筛选的适宜选择压为Kan 10 mg/L;适宜的抑菌剂为Carb 100 mg/L。     

农杆菌介导的朝鲜碱茅PuP5CS基因转化紫花苜蓿的研究

为提高紫花苜蓿(Medicago sativa)的抗逆性,利用在朝鲜碱茅(Puccinellia chinampoensis)已克隆的Pu P5CS基因成功构建了p CAMBIA3300-Pu P5CS表达载体,以子叶为外植体,通过农杆菌介导共培养法转化紫花苜蓿"公农5号"(M.sativa cv.Gongnong No.5),并以2.0 mg·L-1的草铵膦进行筛选,抗性愈伤组织诱导率为22.4%,经草铵膦筛选的植株进行PCR检测和RT-PCR检测。结果显示,共获得11株转化植株,表明Pu P5CS基因已转入T0紫花苜蓿植株,且能够在RNA水平上正常表达。     

影响农杆菌介导的大豆基因转化因素的研究

通过农杆菌介导法用含NPT－Ⅱ和Barnase基因导入到大豆幼胚，大豆子叶节叶，然后经过含Kan的筛选培养基中连续筛选，获得一批Barnase转基因植株。经PCR扩增结果，证实此基因已整合到大豆中，在当代植株中生物学特性观察，花粉粒不育率在98％。     

Agrobacterium-Mediated Transfer of Arabidopsis ICE1 Gene into Lemon （Citrus Limon （L.） Burm. F. cv. Eureka）

The Arabidopsis ICEI （inducer of CBF expression 1） gene was cloned through RT-PCR of Arabidopsis cDNAs and introduced into the lemon （Citrus Limon （L.） Burm. F. cv. Eureka） genome using Agrobacterium-mediated transformation method. Epicotyl segments from in vitro grown lemon seedlings were co-cultivated with A. tumefaciens strain EHA 105 carrying the binary plasmid pMVICE1, whose T-DNA region contain ICEI gene driven by 35S CaMV promoter. Among 320 epicotyl segments inoculated, 71 explants responded and regenerated 51 elongated shoots. These shoots were subjected to an extra month of kanamycin exposure. In this way, the number of escapes reduced. Thirteen of 31 survived shoots formed roots and 7 were tested positive using PCR technique. Southern blot analyses confirmed PCR results and demonstrated that more than two copies of the ICE1 gene were integrated into the lemon genome.     

转hrpZpsta抗病基因大豆的研究

【目的】将具有广谱抗病性的hrpZpsta基因导入大豆,为培育抗灰斑病的转基因大豆新品系奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法,以大豆子叶节为受体,将具有广谱抗性的hrpZpsta基因转入大豆品种"吉林30"中,以耐盐基因badh作为筛选标记性基因,经过抗性筛选,对转基因植株进行PCR检测、Southern杂交和RT-PCR检测分析。【结果】确定的NaCl筛选浓度为200mmol/L。对T1、T2和T3代转基因植株进行PCR检测,得到T1代阳性植株30株,T2代45株,T3代284株,说明外源hrpZpsta基因在转基因后代中能够遗传。Southern杂交结果表明,外源目的基因hrpZpsta已经整合进大豆基因组中,且整合位点不尽相同。RT-PCR结果表明,hrpZpsta基因在受体大豆中获得表达。【结论】获得了hrpZpsta基因遗传表达的T3代转基因大豆株系。     

Effect of Phytosulfokine-a on Agrobacterium-Mediated Transformation in Rice

Phytosulfokine- α （PSK- α ）, a biologically active peptide acting as a growth factor, plays a key role in cellular differentiation and proliferation. To test if PSK- α has some influence on agrobacterium-mediated transformation in rice, PSK-α at a series of concentrations was added into co-culture medium respectively. The results showed that PSK- α indeed affected the recovery of resistant calli and the transformation frequency of rice varieties Taipei 309 and Lijiangxintuanheigu, PSK- α at the concentration of 10 nmol/L could increase induction of resistant callus and efficiency of transformation, with a 11% and 4.9% top increase, respectively than the control. However, PSK- αat 200 nmol/L could inhibit the induction of the resistant calli. Further more, the effect of PSK-α on agrobacterium-mediated transformation is related with the concentration of 2, 4-D in selection medium. Higher induction rate of resistant calli was obtained from tissues treated with PSK- α plus 2 mg/L 2, 4-D.     

植物抗病基因snc1在超级杂交稻父本0293中的遗传转化

以超级杂交稻父本0293为材料,利用农杆菌介导基因转化法研究植物抗病基因snc1在超级杂交稻父本中的遗传转化。结果表明:0293成熟胚愈伤组织的最适诱导培养基为NMB诱导培养基,2,4–D和6–BA的最适质量浓度分别为3.0和0.2 mg/L;以LB液体培养的农杆菌转化能力最强,抽真空转化方式获得的抗性愈伤率较高,最适共培养时间为2 d;麦芽糖为抗性愈伤组织分化的最适碳源,NMB+KT 0.4 mg/L+6–BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IAA 0.5 mg/L为较适合的分化培养基;通过优化农杆菌介导的遗传转化条件,共获得6株含目的基因snc1的转化植株。     

MAP30基因转化烟草的研究

通过转基因技术,利用农杆菌介导法,将pBIMAP30植物表达载体转化烟草,Kan筛选抗性苗,选择植株健壮、根系发达的抗性植株,提取叶片DNA进行PCR鉴定,获得阳性转基因烟草.采用RT-PCR方法证实MAP30基因能够在转录水平上正常表达.该研究为探讨具有药用价值的植物资源奠定理论基础,并为获得抗病毒、抗肿瘤功能性药物蛋白的植物新品系研发提供一定的技术支持     

根癌农杆菌介导的‘魏可’葡萄遗传转化体系的优化

以‘魏可’葡萄离体叶片为外植体,利用植物表达载体上含有卡那霉素抗性基因(nptⅡ)的根癌农杆菌LBA4404(pCAMBIA2301)对影响‘魏可’葡萄遗传转化效率的因素进行系统研究。结果表明,最佳农杆菌介导‘魏可’葡萄遗传转化体系为农杆菌侵染4 min,共培养3 d,卡那霉素质量浓度5 mg·L-1,羧苄青霉素质量浓度200 mg·L-1。采用此体系对‘魏可’葡萄进行转化,共获得9株抗性苗。利用GUS组织化学染色、PCR扩增的方法检测,结果表明,有4株通过了PCR检测,1株通过了RT-PCR检测,初步证明nptⅡ基因已经整合进入‘魏可’葡萄基因组中。将PCR产物回收,经测序验证nptⅡ基因完全整合进入‘魏可’葡萄基因组中。对CK及经PCR检测呈阳性的株系进行卡那霉素抗性鉴定,发现PCR呈阳性的株系均比CK抗Kan的能力明显增强。     

农杆菌介导的油菜遗传转化研究进展

综述油菜遗传转化中再生体系的建立、农杆菌侵染方法、适宜菌株及载体选择等方面的研究进展,并对转化中寄主基因型、目的基因及其启动子的选择、筛选方法、外源基因稳定性等方面存在的问题进行了分析与讨论,为优化油菜等芸薹属的遗传转化提出可行性建议.