混合菌发酵臭鳜鱼工艺研究

接种中国根霉12和产乳酸芽孢杆菌DU-106混合发酵制备臭鳜鱼，考察加盐量、根霉菌液接种量、乳酸菌粉添加量、发酵时间对臭鳜鱼感官评分的影响，并在单因素实验的基础上进行响应面优化，得出最优加工工艺条件为：加盐量1.4%，辅料添加量0.5%，根霉菌液接种量2%，乳酸菌粉添加量1.4%，15℃发酵8 d。此条件下得到的臭鳜鱼感官评分9.4，属于优良级别。相比臭味刺鼻的自然发酵臭鳜鱼，接种发酵的臭鳜鱼风味和滋味上增加了酸味，更有利于蒜瓣状肉质的形成，酸臭味丰富浓郁而柔和、富有层次感。中国根霉12和产乳酸芽孢杆菌DU-106可应用于臭鳜鱼发酵。     

LbCas12a蛋白的原核表达及活性检测

【目的】 获得具有体外切割活性的来自毛螺旋菌属(Lachnospiraceae) ND2006的LbCas12a蛋白，以期为LbCas12a的应用研究提供重要的生物学工具。【方法】 根据pMBP-LbCas12a质粒(Addgene，113431)的基因序列合成LbCas12a基因，并将其与pET-28a(+)线性化载体进行同源重组，构建重组质粒pET28a-LbCas12a，经测序和NheⅠ、SalⅠ双酶切鉴定后将阳性重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行IPTG诱导表达。通过12% SDS-PAGE凝胶电泳检测确定IPTG诱导的最佳浓度及温度，鉴定重组蛋白的表达形式，通过Ni-NTA树脂亲和层析的方法进行纯化、超滤法浓缩，BCA法检测蛋白浓度。将浓缩后的LbCas12a与猪细小病毒(PPV)靶标DNA、CRISPR RNA (crRNA)及偶联荧光基团的非特异性单链DNA(ssDNA)探针FQ共孵育，设置1个无LbCas12a蛋白的对照组、4个不同蛋白浓度(125、250、500、1 000 nmol/L)的试验组，检测不同组别ssDNA探针的荧光强度，检测测试位点PPV活性。【结果】 测序和NheⅠ、SalⅠ双酶切鉴定结果表明，重组质粒pET28a-LbCas12a构建成功且无移码突变。12% SDS-PAGE凝胶电泳检测结果表明，IPTG诱导表达的最佳浓度为0.5 mmol/L，最佳温度为37 ℃，表达形式主要为可溶性表达。蛋白浓度检测结果表明，浓缩后的蛋白浓度为485 ng/μL，质量为143 ku。活性检测结果表明，125、250、500、1 000 nmol/L LbCas12a蛋白组的荧光强度均极显著高于对照组(P<0.01)。【结论】 本研究成功表达出高活性的LbCas12a蛋白，且LbCas12a蛋白具有体外切割ssDNA的反式活性，为后续基于CRISPR-LbCas12a系统的分子检测技术奠定了基础。