西方蜜蜂（Apis mellifera L.）sRNA的富集与文库检测

 【目的】提取及扩增蜜蜂（Apis mellifera L）sRNA,并构建文库检测富集结果是否满足高通量测序研究要求。【方法】取蜜蜂3个级型不同发育阶段个体作为材料,分别提取总RNA后混合,从中分离出15～40nt的sRNA,反转成cDNA后构建文库,进行蓝白斑筛选。挑选288个单克隆进行测序,对测序结果进行分析。【结果】有效序列为214条,插入的cDNA片段大小范围为15～39 bp。其中,sme-miR-71c miRNA 65条,ncRNA（包括tm-RNA、intron_ghI、5.8s rRNA）5条,tRNA 28条,siRNA及其他sRNA 33条, CDS 1条,未知序列82条。【结论】本实验采用的方法能有效富集蜜蜂sRNA,能够满足高通量测序从中识别出蜜蜂miRNA的研究。     

新一代测序技术的应用及其对作物分子育种的影响

作为分子生物学研究中最常用的技术之一,近年来DNA测序技术的快速发展,催生了一批基因组学和后基因组学研究手段。本文概述了以Roche/454Genome Sequencer FLX System、Illumina/Solexa Ge-nome Analyer IIx和ABI SOLID System等测序平台为标志的新一代测序技术的基本原理以及优缺点,并分析了目前的主要应用情况,展望了新技术的发展对作物分子育种产生的影响。     

大豆分子育种研究新进展

分子育种是当今世界大豆产业发展的主要推动力,已成为国际大豆种业竞争的核心技术。介绍了2012-2013年间国内外大豆分子育种研究的新进展：以高通量测序为基础的功能基因组学研究更深入、更广泛;克隆并验证了与开花、产量、结瘤和抗逆性等重要性状相关的基因;发掘出一批新的分子标记或QTL,强化了传统分子标记与新技术、新方法的有机结合;在遗传转化体系优化方面取得了一些新进展,并在大豆中对一些目标基因进行了功能鉴定;一批具有抗虫、耐除草剂等单一及复合性状的转基因大豆新品种获得多国安全认证,允许进口食用、饲用或商业化种植,并对今后一段时间内大豆分子育种领域的发展趋势进行了展望。     

连续水旱轮作对水稻冷浸田土壤细菌群落结构的影响

利用高通量测序技术,采用单季稻-冬闲(CK)、油菜-水稻(R-R)、春玉米-水稻(C-R)、紫云英-水稻(M-R)和蚕豆-水稻(B-R)五个处理探究水旱轮作模式对水稻冷浸田土壤细菌群落结构的影响,同时分析了土壤理化因子与细菌群落结构的关系。结果表明:水旱轮作能够显著增加水稻产量18%~44%。与CK相比,绝大多数水旱轮作降低了土壤细菌的丰富度,而细菌多样性与CK处理无显著差异。变形菌门和酸杆菌门为土壤中的优势细菌类群,其中变形菌门的丰度最高。与CK相比,轮作后酸杆菌、放线菌、硝化螺旋菌、慢生根瘤菌和亚硝化螺菌等参与碳氮循环的菌群丰度明显增加。聚类分析表明CK和M-R轮作土壤细菌群落单独聚为一类,而B-R、C-R和R-R轮作土壤聚为另一类。冗余分析表明土壤全磷、有效磷和p H是影响水旱轮作土壤细菌群落结构的主要因子。     

甘薯病毒病原相关的microRNA的挖掘及分析

【目的】甘薯的病毒种类比较多,不同的病毒感染会引起相应的症状变化,田间自然发病的甘薯表型不一,这可能与病毒感染类型有关。论文旨在鉴定和研究甘薯中与不同甘薯病毒感染相关的microRNA（miRNA）。【方法】采用Illumina公司高通量测序技术,对来自福建泉州地区同一品种（龙薯9号）、具有不同症状的叶片样本（畸形黄化、疱疹、褪绿矮化和曲叶,样本编号分别为Fj01、Fj02、Fj03和1H）进行高通量测序,利用生物信息学手段挖掘和分析差异表达miRNA,并对差异miRNA和病毒表达进行PCR验证,鉴定基因和病毒在样本中表达情况,分析测序数据的可靠性,利用生物信息学分析进行miRNA靶基因预测和功能分析,探究差异miRNA与病毒种类的相关性。【结果】通过与病毒数据库的比对,发现Fj01、Fj02、Fj03样本（除1H外）均感染了甘薯常见病毒,如甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV）、甘薯病毒2号（Sweet potato virus 2,SPV2）、甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）、甘薯G病毒（Sweet potato virus G,SPVG）、甘薯C病毒（Sweet potato virus C,SPVC）等,但Fj01、Fj02和Fj03这3个样本的症状并不一致,样本之间只在甘薯不常见的病毒种类中有差异,通过PCR验证了SPFMV和SPVC病毒在样本中的表达情况与测序数据基本一致。在4个样本中共鉴定出679个已知的miRNA和1 004个新的miRNA,通过配对比较分析,其中288个已知的miRNA和433个新的miRNA在4个样本之间有差异性表达,并且这些miRNAs,如miR-156、miR-157、miR-166等家族的成员在4个样本中表达模式各异。同时,采用实时荧光定量PCR验证几个差异miRNAs（如miR-156、novel-miR-40和miR-319m）在各个样本间的表达情况与测序结果基本一致,另外,与脱毒苗样本进行比较,检测到3个miRNA（miR-160a、miR-2096和miR-5387b）在4个症状样本中具有不同程度的上调表达,证明miRNA的表达与植株的表型有关。通过对miRNA靶基因的预测与分析,发现这些差异miRNA的靶基因多数为转录调控因子,编码蛋白多含有ZFP、WD、Myb、SPL等功能区域,这些因子多参与调控植物的基因、代谢通路和抗原识别等来调控植物生长发育、形态建成和抗逆性,表明这些miRNA靶基因的功能多样性。【结论】不同病毒感染确实能够引起miRNA差异表达,并且这些miRNA通过其靶基因参与调控植物的生长发育、抗胁迫性和防御。     

草地早熟禾干旱胁迫转录组差异性分析

干旱是影响草地早熟禾生产力的主要因素之一。在没有参考基因组的情况下, 为了揭示草地早熟禾在干旱处理下基因表达谱的变化, 本文采用了高通量Illumina Hiseq测序平台对草地早熟禾的对照组(CK)与干旱处理组(D)进行转录组测序, 并对测序数据进行了分析研究, 进一步探究了草地早熟禾干旱应答的分子机制。结果表明, 在干旱处理下共检测到24465个差异表达的基因, 筛选后获得4143个上调基因和4415个下调基因, 共占差异表达基因总数的34.98%。经富集分析后得, 与蛋白激酶、蛋白磷酸酶、碳代谢以及ABA等相关的基因可以作为研究草地早熟禾干旱响应机制的主要研究对象。qRT-PCR分析表明, 随机选出的8个差异性表达基因的表达趋势与高通量测序结果相一致。此外, 还候选了吲哚-3-甘油磷酸合成酶、蛋白磷酸酶、已糖激酶、钙结合蛋白、叶绿素a/b结合蛋白等基因作为与草地早熟禾干旱胁迫相关的应答候选基因, 为揭示草地早熟禾耐旱分子机制奠定了基础。     

BMP2对猪前体脂肪细胞差异表达miRNA1的影响

采用高通量测序技术构建经骨形态发生蛋白-2(BMP2)处理前后的猪前体脂肪细胞差异miRNA表达谱,以明确BMP2影响的功能性miRNA。结果显示:BMP2刺激猪前体脂肪细胞前后共有55个miRNAs存在较大的表达差异,包括30个上调表达的miRNAs和25个下调表达的miRNAs;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测表明,高通量测序数据结果正确可靠;经miRnada和RNAhybrid这2个软件对差异表达的miRNAs进行靶基因预测及靶基因进行GO和KEGG Pathway分析,发现靶基因主要富集在Notch信号通路、胰岛素信号通路、甘油磷酯代谢、MAPK信号通路、半乳糖代谢、类固醇激素的生物合成等通路。结果表明:BMP2作为前体脂肪细胞分化重要调控因子,可能通过介导miRNA及其调控的某些关键基因的表达,从而影响前体脂肪细胞外基质与受体的结合、胰岛素利用、脂类和糖的合成与代谢等生物学过程,最终作用于前体脂肪细胞的分化和脂质沉积。     

新发动物疫病检测方法研究及口岸检疫应用展望

目前我国口岸已有的一些疫病检测方法,主要是针对进境动物检疫疫病名录中提及的已知病原,而针对新发病原的检测方法较少。本文介绍了传统病原的检测方法,包括病原分离和培养、血清学方法、蛋白质免疫印迹和电子显微镜观察等,阐述了新型分子生物学检测方法,如随机引物PCR法、序列非依赖性单引物扩增技术、小RNA深度测序技术、病毒宏基因组学技术等,并对上述方法在口岸中的应用前景进行了分析。     

金华猪和长白猪粪便微生物移植小鼠的肠道古菌结构分析

本试验旨在比较肥胖型的金华猪和瘦肉型的长白猪肠道古菌结构的差异,分析菌群移植小鼠肠道古菌结构。采集金华猪和长白猪的新鲜粪便,通过灌胃移植到经广谱抗生素处理过的小鼠肠道中,提取2种猪粪便及其移植小鼠的盲肠内容物总基因组DNA,使用古菌通用引物对古菌16S rRNA的V4区进行PCR扩增,通过Illumina Hiseq测序平台对扩增产物进行高通量测序,使用QIIME等软件对测序序列进行分析统计。结果表明:金华猪和长白猪粪便及其移植小鼠盲肠内容物中的古菌主要包含3个门,分别为奇古菌门(Thaumarchaeota)、广古菌门(Euryarchaeota)和泉古菌门(Crenarchaeota),其中金华猪粪便中广古菌门的丰度高于长白猪;在属水平上主要包含4个已知属,优势属为餐古菌属(Cenarchaeum)。二者移植小鼠的盲肠内容物古菌结构,在门水平上,移植小鼠的奇古菌门比例占70%以上;奇古菌门的古菌几乎全部来源于餐古菌属;在门和属的水平上,金华猪和长白猪粪便移植小鼠的盲肠古菌结构无显著差异(P0.05),但基于操作分类单元(OTU)水平的主成分分析显示出很好的组内聚集。由此可见,奇古菌门的餐古菌属是金华猪和长白猪粪便和其移植小鼠盲肠中的优势古菌;金华猪粪便中广古菌门的丰度高于长白猪粪便,且二者移植小鼠盲肠内容物之间古菌结构在OTU水平上存在一定的差异。     

不同种植年限条件下黄花蒿根际土壤微生物生物量、酶活性及真菌群落组成

试验采集未种植、种植1年、3年和5年的黄花蒿根际土壤,采用常规分析和Illumina MiSeq高通量测序技术,研究了土壤微生物生物量、酶活性及真菌群落组成。结果表明,在人工种植黄花蒿的土壤中,微生物生物量碳氮减少,碳氮比例改变;脱氢酶、脲酶和蔗糖酶活性降低,酸性磷酸酶活性增强;说明黄花蒿释放的化感物质选择性抑制了土壤微生物生长、繁殖和代谢。在不同种植年限的土壤中,主成分分析显示代表不同种植年限土壤真菌群落的点在坐标图中分布距离较远,表明它们的群落组成发生了显著变化(P<0.05)。此外,子囊菌门占土壤真菌的66.10%~95.28%,黄花蒿种植时间影响真菌门类和优势真菌的丰富度。在前20种优势真菌中,有14种共存于不同种植年限的土壤中,每种土壤中存在1~3种独有真菌,说明土壤是决定真菌种群组成的主导因素,又因种植黄花蒿而改变。在栽培1~5年的黄花蒿土壤中,优势菌株中出现蒿属的常见病菌——蒿白粉菌和艾菊柄锈菌,提高相应病害的发生风险。