人类PGAM基因的电子克隆及生物信息学分析

采用生物信息学的方法,从UniGene簇Hs.632918中选择1条人磷酸甘油酸变位酶（Phosphoglycerate mu-tase,PGAM）的表达序列标签（Expressed sequence tag,EST）AY007118.1作为种子序列进行电子步移,得到一长为2 750 bp的cDNA序列.对其进行开放阅读框（Open reading frame,ORF）分析,发现该cDNA序列具有完整的ORF框架,ORF长度765 bp,共编码254个氨基酸.cDNA 5’端具有Kozak序列、TATA盒和CAAT框,3’端具有加尾信号和Poly A尾巴.对该序列进行限制性酶切位点、CpG岛、基因定位分析,结果发现了81个酶切位点,一个长度为627 bp、GC含量为55%、Y值为0.695的CpG岛,最后将该基因定位于第12号染色体的长臂上.同时对PGAM蛋白的二级结构和特殊结构进行了初步预测.结果显示,PGAM蛋白中存在α螺旋、β-折叠片和无规卷曲结构,没有跨膜结构的片段,无信号肽,蛋白定位于细胞质或细胞核.     

‘KRS’芒果发育过程中糖积累与代谢相关酶活性的关系

[目的]探讨芒果果实糖积累和转化的生理机制。[方法]以‘KRS’芒为试材,研究芒果果实生长发育和成熟过程中的淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖含量变化,与淀粉酶、蔗糖代谢相关酶——酸性转化酶(AI)、中性转化酶(NI)、蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性的相关性。[结果]果实发育前期‘KRS’主要积累淀粉、葡萄糖和果糖,成熟时淀粉酶活性降至最低,淀粉水解快速积累蔗糖。在整个发育过程中AI活性维持最高,完熟时降低,SPS在果实发育中期略有降低,完熟时升至最高,SS和NI一直很低且较稳定。相关性分析表明淀粉含量与酸性转化酶活性呈显著正相关;蔗糖、葡萄糖含量与SPS、SS呈极显著正相关;果糖含量与SS、AI均呈极显著正相关。[结论]芒果成熟时淀粉分解、AI活性降低和SPS、SS活性的增加是引起‘KRS’果实蔗糖积累的主要因子。     

改性核桃壳处理含Cr(Ⅵ)废水的效果

[目的]研究改性核桃壳对含六价铬[Cr(Ⅵ)]废水的吸附效果,为核桃壳资源化开发利用提供新途径.[方法J以废弃核桃壳为原料,采用磷酸改性法制备核桃壳基吸附材料,通过扫描电镜(SEM)和红外光谱仪(FTIR)表征材料结构,并考察溶液初始pH、改性核桃壳投加量、吸附时间等因素对改性核桃壳处理含Cr(Ⅵ)废水效果的影响,同时研究改性核桃壳对Cr(Ⅵ)吸附过程的动力学模型和等温线模型.[结果]改性后核桃壳表面更粗糙且多孔,官能团结构改变;在Cr(Ⅵ)初始质量浓度100 mg/L、改性核桃壳投加量1.0 g、溶液pH 2.0的条件下吸附处理180 min,改性核桃壳对Cr(Ⅵ)的吸附率达99.65%,高于未改性核桃壳的吸附率(43.64%);改性核桃壳的废水处理过程符合准二级动力学方程和Langmuir等温吸附式.[结论]采用磷酸改性法制备的改性核桃壳对Cr(Ⅵ)有较强的吸附能力,且操作简单、反应条件易于控制,可用于含Cr(Ⅵ)废水处理.     

玉米磷酸丙糖异构酶基因的克隆及原核表达

为克隆玉米(Zea mays L.)磷酸丙糖异构酶基因ZmTPI,并进行序列分析和原核表达研究,根据玉米TPI基因的cDNA全长序列设计特异引物,以玉米叶片总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增得到了约750bp的基因编码区cDNA片段,T/A克隆后进行了序列测定及序列分析,随后将克隆到的该基因片段构建到原核表达载体PGEX-4T-1上,得到的重组表达质粒GST-ZmTPI转化Bl21进行融合蛋白的诱导表达及纯化。结果显示,玉米ZmTPI(GenBank:EU959275)cDNA全长1 216bp,753bp开放阅读框编码250个氨基酸,推测分子量26.7205kDa,理论等电点为5.12;该蛋白具有高度保守的TIM结构域,与其它高等植物的同源蛋白有很高的相似性;进化树分析表明,玉米TPI与甘蔗亲缘关系最近,处于同一进化支;SDS-PAGE检测结果显示,成功诱导表达并且纯化了与预期大小一致的融合蛋白。玉米ZmTPI蛋白的基因克隆和原核表达及纯化的成功,为进一步研究目的蛋白的酶活性质及生物学功能奠定了基础。     

“细菌型”pepc2基因反向表达载体构建及在莱茵衣藻中的表达

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC, EC 4.1.1.31)在植物碳代谢中处于代谢纽的关键位置,是调节细胞蛋白质和脂肪酸含量的关键酶,通过抑制pepc基因的表达,可以提高细胞的含油率。通过克隆莱茵衣藻“细菌型”pepc2/基因的部分序列（简称Crpepc2）和莱茵衣藻融合启动子Hsp70A RBCS2（简称HR）,将HR和Crpepc2片段插入pSP124s中,获得Crpepc2反向表达的莱茵衣藻高效表达载体pSP124s-HR-reve-Crpepc2-。利用基因枪将pSP24s和pSP124s-HR-reve-Crpepc2分别转入莱茵衣藻cc 503藻株,得到空质粒型和反向型突变藻株。利用qPCR检测莱茵衣藻野生型、空质粒型和反向型藻株“细菌型”pepc2/基因的相对表达量,结果表明空质粒的导入对莱茵衣藻pepc2/基因的相对表达量影响很小,为野生型的92.95%;而反向型pepc2/基因的导入明显降低了莱茵衣藻pepc2/基因的相对表达量,仅为野生型的2.94%。该结果一方面说明我们建立了利用qPCR快速检测莱茵衣藻pepc2/基因相对表达量的方法,另一方面也证明利用Crpepc2反向表达的方法（即“反向载体技术”）可以有效的抑制莱茵衣藻pepc2/基因的表达,为进一步筛选稳定的含油量高的藻株奠定了良好的基础。     

甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SotSPSB的克隆及原核表达

【目的】克隆甘蔗B家族s0心PsB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础。【方法】在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列。扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue－2上导入大肠杆菌BL21（DE3）中表达。【结果】通过比对B家族中进化关系很近的玉米（Zeamays）ZmSPS1和水稻（Oryzasativa）OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因（SolSPSB）2330bp序列。结合5’－RACE和3’－RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225bp的开放阅读框（0I江）;起始密码子（ATG）位于转录起始位点后56bp处,终止密码子（TGA）后有一段201bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm—SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94．7％和81．3％,氨基酸序列同源性分别为96．0％和83．9％;其理论分子量Mw=118．96kDa,等电点pI=6．30。经原核表达后纯化获得带6xHis标签的融合蛋白。【结论】克隆获得甘蔗B家族Sol-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SoPSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。     

蜜蜂磷酸丙糖异构酶基因(AmTpi)全长cDNA的电子克隆及其验证

用电子克隆的方法获得蜜蜂(Apis mellifera)磷酸丙糖异构酶基因(triosephosphate isomerase,Tpi),对该基因序列进行克隆及生物信息学分析.结果表明,该基因全长1768 bp,具有完整的开放阅读框架(ORF),编码247个氨基酸的蛋白;其编码的氨基酸序列与果蝇(Drosophila melanogaster)、家蚕(Bombyxmori)、黄粉虫(Tenebrio molitor)、按蚊(Anopheles gambiae)、烟蚜夜蛾(Heliothis virescens)的磷酸丙糖异构酶的蛋白序列具有较高的保守性.     

小麦导入磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）基因的初步研究

[目的]将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）基因导入普通小麦临优145。[方法]利用根癌农杆菌遗传转化系统,以普通小麦临优145为材料,将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）基因,导入小麦胚性愈伤组织中,用含潮霉素（hyg）的筛选培养基连续筛选,并从分子水平上检测该基因。[结果]获得了hyg抗性植株,经GUS组织化学染色检测表明,抗性苗叶片被染成了深蓝色;PCR检测出目标条带。[结论]初步证明磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）基因已经导入受体材料中。     

苹果L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶cDNA克隆及其表达

 【目的】了解苹果果实L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶(L-galactose-1-phosphate phosphatase, GPP)基因的特性,探索苹果GPP基因表达特性及其与抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)水平的关系。【方法】通过RT-PCR从苹果果实中克隆GPP 全长 cDNA,分析其序列特征,进行原核表达,制备GPP特异抗体,分析GPP mRNA及其蛋白表达水平与苹果不同组织AsA的关系。【结果】从‘嘎啦’苹果果实中克隆的GPP cDNA(GenBank登录号为 FJ752240)包含的最大开放阅读框(open reading frame,ORF)为813 bp,编码270个氨基酸残基,预测分子量为29 kD,该基因与其它植物报道的GPP基因具有较高的相似性,但与肌醇-1-磷酸磷酸酶基因差异较大。构建的pET-32a(＋)-GPP载体在大肠杆菌BL21(E. coli BL21)中异源表达后,获得主要以包涵体存在约50 kD的融合蛋白GPP-His(His约21 kD)。以该蛋白制备抗体,与重组蛋白的Western杂交表明该抗体能与GPP发生特异反应。对苹果可溶性蛋白杂交显示,苹果体内GPP蛋白约33 kD。在苹果不同组织中,GPP mRNA与蛋白质的相对表达水平与AsA含量存在明显的一致性。【结论】以单体形式存在的苹果GPP蛋白具有翻译后修饰特性,且该基因的表达在苹果AsA合成调控中可能起重要作用。     

家稗丙酮酸磷酸双激酶序列分析及三维结构建模

【研究目的】目前已从许多种植物中克隆了其PPDK基因,但是对于其蛋白结构的分析尚未报道,此文通过生物信息学方法对家稗PPDK的序列进行了分析,并对其三维结构进行了建模分析;【研究方法】利用DNASTAR、Vector NTI 9、SignalP等生物信息学平台对[Echinochloa crusgalli var frumentacea(Roxb.)W.F.Wight]丙酮酸磷酸双激酶(Pyruvate orthophosphate dikinase)进行了序列分析和三维结构建模;【研究结果】家稗丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)同来自于高等植物的PPDK具有较高的同源性,无信号肽,存在17个跨膜结构区,二级结构是由许多螺旋、转角和少量折叠构成。同时在一二级结构分析的基础上,利用同源建模的方法完成了三维结构的建模。【结论】家稗PPDK蛋白同来自高等植物中的更为相近,无信号肽,有17个跨膜结构区,其三维结构为一同源四聚体。