cDNA-AFLP技术在植物遗传育种研究上的应用

cDNA-AFLP是一种研究基因表达的新技术。该技术具有重复性好、稳定、可靠的特点,可对生物体转录组进行全面、系统的分析。本文主要介绍cDNA-AFLP的原理、方法和技术特点,并概述其在植物遗传育种研究上的应用。     

转入反义ScP5CS基因烟草植株对PEG和NaCl处理的反应

以转入甘蔗脯氨酸合成酶基因ScP5CS反义片段的转基因烟草与野生型烟草为材料,研究PEG6000与NaCl处理对转基因与野生型烟草植株生长及其T0代种子萌发的影响。结果表明,在17mmol/L NaCl与1%PEG6000胁迫下转入ScP5CS反义基因片段的烟草植株矮小,叶片容易发黄,根系发育迟缓,根长缩短;转基因烟草T0代种子在200mmol/L NaCl胁迫时其发芽率明显受到抑制,并随着盐胁迫处理时间达到第55天时,在50mmol/L NaCl胁迫下其叶片严重黄化,而野生型与转入空载体株系则相反。PEG6000处理对转基因烟草T0代种子萌发影响不大。可见,甘蔗ScP5CS基因在烟草中的反义表达,部分抑制了烟草P5CS基因的活力。     

海南根瘤菌I66 nodD基因DNA片段的克隆

从海南根瘤菌（Rhizobium hainanense)I66提取总DNA，用XbaI完全酶切，然后用苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti)042B的nodDDNA片段作探针进行Southern杂交，杂现2条含有nodD基因DNA征段的阳性条带，分别为4.0和6.0kb，电泳回收含有4.0-6.0kb的DNA片段，用pUC18作载体连接，并转化E.coliDH5α，构建含有nodD的部分基因文库，提取该文库的质粒与nodD探针做点杂交，筛选到nodD的阳性克隆，称为pUOD75。再将pUOD75的nodD片段克隆到pBBR-MCS-5,构建成pBOD75。用两亲本杂交，把pBOD75转入豌豆根瘤菌蚕豆生物型（Rhizobium eguminosarum bv.viciae)根瘤菌I66nodD基因在毛地黄黄酮诱导下得到表达，说明其表达产物可能具有结瘤调节功能。     

花生荚果钙素吸收机制研究

采用45Ca微观放射自显影、电子探针及特异性抑制剂研究花生荚果钙素吸收机制,结果表明,Ca2+是通过主动吸收由外界进入细胞质中,并以共质体途径在组织和细胞间运输,外果皮的周皮层和中果皮的纤维细胞层对Ca2+质外体运输有一定阻碍作用。钙通道抑制剂与ATP酶特异性抑制剂处理,中果皮和内果皮的薄壁细胞内未见45Ca显影,大量45Ca出现在周皮层,仅微量的45Ca到达中果皮细胞间隙和纤维细胞层质外体空间。电子探针的结果也可看出高钙峰出现在周皮层,而对照处理荚果整个组织的共质体和质外体均有45a的显影,且由外果皮向内,组织中的钙呈逆浓度梯度分布。2,4二硝基酸可抑制荚果钙素吸收速率,其抑制率达7092％。荚果钙素吸收动力学的结果表明,当Ca2+浓度为0-0.5mmol/L时,其吸收速率符合Michaelis-Menten酶动力学模型,Km值为0.0135mmol/L,Fmax为13210-4.mol/(cm2h);而当Ca2+浓度为1-5mmol/L范围时,其表现出复杂的吸收特征,此时Km和Fmax均无法得出明确的数值;供钙浓度为0.5-2.0mmol/L时,荚果干重及果仁干重与吸钙量均可达到最大并趋于稳定。     

基于生物信息学分析的水稻无机焦磷酸化酶基因OsIP1的克隆及其遗传转化

 无机焦磷酸化酶在植物体内催化焦磷酸基团分解为磷酸基团的反应,而焦磷酸的及时降解,被认为是原初光合产物合成双糖特别是蔗糖,进而进行长距离运输的关键步骤之一。但是,蔗糖在维管束中的运输需要焦磷酸,因此,在叶肉细胞中特异性过表达焦磷酸化酶基因,被认为是拉动和促进光合作用的关键措施之一。对水稻中约30个无机焦磷酸化酶编码基因进行氨基酸序列比较、结构域特征、亚细胞定位预测以及上游顺式元件释义等生物信息学分析,进而克隆了1个预测为编码胞质型可溶性无机焦磷酸化酶的基因OsIP1（Os04g0687100）,并将其与叶肉细胞特异性启动子cyFBPase相连,构建成嵌合基因cyFBPase:OsIP1;通过农杆菌转化法将其转入2个水稻品种中,累计获得48个阳性转基因植株。     

水稻耐盐性数量性状位点的初步检测

用RFLP分析技术和分蘖株系法对由耐盐性品种Pokkali和盐敏感品种Peta配制的BC1(Peta/Pokkali∥Peta)群体分别检测水稻苗期和成熟期耐盐性数量性状位点(QTLs)。表型鉴定在含(处理)或不含(对照)60 mol/m3 NaCl的营养液中进行,苗期观测盐害级别、苗Na+含量和鲜重/干重比值3项指标,成熟期测定10种农艺性状处理与对照的相对值。从水稻12条染色体上筛选出43个多态性标记,对上述指标分别作点分析,共检出15个连锁标记。连锁标记的分布特点显示,在研究所涉及的基因组范围内存在4个影响苗期耐盐性的QTL,其增效等位基因均来自耐盐品种Pokkali;影响成熟期耐盐性的QTL分布于7条染色体的1或2个连锁区间上,其有利基因来自双亲;RG678和RZ400B~RZ792附近的2个QTL在全生育期都能表达较强耐盐性。     

甘蓝型油菜BAN同源基因片段克隆与序列分析

参照拟南芥（Arabidopsis thaliana)BAN基因和cDNA的保守序列设计引物，对甘蓝型、白菜型、芥菜型油菜和拟南芥及其它十字花科栽培品种的基因组总DNA进行PCR扩增，均获得与拟南芥BAN基因扩增片段大小极其相似的PCR扩增产物，表明BAN基因可能广泛存在于十字花科植物中。甘蓝型油菜和拟南芥BAN扩增片段测序比较分析显示，拟南芥BAN片段（779bp)与已往的报道完全相同，甘蓝型油菜的BAN片段（780bp)与拟南芥BAN外显子的同源性为90％，但与内含子的同源性仅为74％。甘蓝型油菜BAN氨基酸序列与80多种植物的NADPH还原酶类有不同程度的同源性。     

香蕉不同生育期根际土壤细菌群落变化研究

土壤微生物是土壤质量和健康的敏感性指标。研究认为,根际微生物区系失调是作物土传病害发生的一个重要原因。通过对香蕉不同生长期根际土壤中细菌多样性和数量的研究,对香蕉枯萎病发生的机理及生物防治具有重要意义。实验采用Real-time PCR和T-RFLP技术,对巴西蕉不同生长期根际细菌数量和多样性进行了研究。结果表明:随着香蕉生长期的增加,根际土壤细菌数量从3月的1.1×1010copies/g土壤逐渐增加到7月的2.7×1010copies/g土壤,随后逐渐减少。然而,根际细菌多样性从3月到7月呈逐渐减少趋势,到7月达到最低,为1.99。另外,不同月份中优势菌的种类和在总细菌中所占的比例也不同。在实验期内,随着香蕉生育期的延长,某些细菌种类大量繁殖,土壤根际细菌群落结构失衡,土壤微生物环境有恶化趋势。     

2个葡萄品系外植体愈伤组织诱导和植株再生

进行了无核白、红地球2个葡萄品系外植体愈伤组织诱导和植株再生的研究。通过葡萄品系无核白、红地球叶片和叶柄外植体的愈伤组织的诱导、再分化,以器官发生途径实现植株再生。结果表明:(1)愈伤组织诱导以MS+BA5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖40g/L培养基最佳,诱导率为35%;同一葡萄品种的叶片与叶柄诱导愈伤组织的频率基本相同,而红地球外植体诱导愈伤组织的频率高于无核白;(2)不定芽的诱导再生以1/2MS+BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+CH500mg/L+蔗糖30g/L培养基最佳,平均诱导率达35.4%;叶柄来源的愈伤组织诱导不定芽的频率高于叶片愈伤组织;(3)根系的诱导以1/2MS+KT0.5mg/L+IBA1.0mg/L+AC2g/L+蔗糖15g/L培养基最佳,无核白和红地球来源的不定芽诱导生根频率基本相同,都在80%以上。     

水稻亚种间单片段代换系的建立

利用微卫星标记辅助选择,建立了29个以台中65为受体、低脚乌尖或窄叶青为供体的单片段代换系,该代换系群体的代换片段分布于9条染色体上,总长度为643.65 cM,平均长度为22.19 cM,覆盖全基因组427.55 cM,覆盖率为23.47%。