鸡α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ基因的克隆和真核表达载体的构建

试验利用Trizol法从鸡肠道组织提取总RNA,采用特异性引物通过RT-PCR扩增出α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ(α-2,3-sialyltransferaseⅠ,ST3GALⅠ)基因的cDNA片段,并将其克隆至pGEM-T easy载体,获得阳性重组质粒,再以阳性重组质粒为模板亚克隆ST3GALⅠ基因的完整ORF区,定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,进行PCR、限制性酶切和DNA序列分析鉴定。结果表明,ST3GALⅠ基因全长1029 bp,测序结果同GenBank数据库收录的序列一致,无任何密码子缺失与突变,插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上的目的基因大小方向均正确。本研究成功构建了pcDNA3.1(+)-ST3GALⅠ真核表达载体,为下一步的真核表达及对ST3GALⅠ基因的功能研究奠定了基础。     

猪PRRSV受体唾液酸黏附素多克隆抗体的制备

唾液酸黏附素(sialoadhesin,Sn)是猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的主要受体,研究该受体在PRRSV感染过程中的作用依赖于特异的抗体.为制备Sn的抗体,首先依据通过DNAstar软件分析的抗原指数,确定编码114个氨基酸的Sn抗原表位基因(Sn114),然后依据大肠杆菌偏爱的密码子对该基因进行密码子优化,并由人工合成该基因.将合成的基因克隆到pET-32a(+)质粒中构建成与硫氧还蛋白(Trx)和6×His融合的Sn114基因原核表达载体,将表达载体转化BL21(DE3)大肠杆菌,在IPTG的诱导下使其表达.利用Ni NTA琼脂糖分离纯化表达的Sn114融合蛋白,再用Sn114融合蛋白免疫家兔,通过ELISA方法检测免疫后家兔血清的抗体滴度,并通过Western blot和细胞结合试验检测抗体的特异性.结果表明,本试验构建的Sn114表达载体能够介导Sn114融合基因在大肠杆菌中进行高效表达,表达量为63 mg/L;用纯化后的Sn114蛋白免疫家兔,免疫后34 d抗体滴度为1∶10 240.抗体特异性检测结果表明,所制备的Sn抗体能与猪肺泡巨噬细胞的Sn抗原进行特异性免疫反应.     

鸡蛋中唾液酸含量的测定

采用高效液相色谱法检测鸡蛋中唾液酸的含量。鸡蛋中的唾液酸在浓度0.5mol/L的NaHSO4溶液中水解30min后,以邻苯二胺为衍生化试剂,在温度80℃水浴中衍生40min。采用AlltimaC18柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相为1.0%四氢呋喃水溶液(含0.2%磷酸)-乙腈(92∶8),流速为1.0mL/min,柱温为35℃,紫外检测波长230nm。此方法具有灵敏度高、重复性好等特点,可以准确地测定鸡蛋中的唾液酸含量和蛋制品中鸡蛋的含量。     

酶联免疫法定量检测市售燕窝及其加工制品中特征蛋白含量

燕窝唾液酸糖蛋白是一种燕窝特征蛋白,在燕窝中高丰度存在且热稳定。其含量的高低指示了燕窝的掺伪情况以及燕窝制品中燕窝的添加量。通过竞争酶联免疫检测方法对市售燕盏及其加工制品中的燕窝唾液酸糖蛋白含量进行调查,结果显示燕窝专柜、农批市场、餐馆等各个环节无论是50元以上包装精美的高档燕盏,还是10元左右的低价散装产品均存在唾液酸糖蛋白含量较低的样品。唾液酸糖蛋白含量和燕窝制品的单价总体上呈正相关,部分燕窝制品未检出燕窝唾液酸糖蛋白。     

轮状病毒入侵细胞机制的研究进展

轮状病毒（Rotavirus,RV）是引起婴幼儿腹泻死亡的主要病原体之一,是一种没有外膜的RNA病毒,由3层同心的蛋白质衣壳包被双链RNA基因组构成。RV入侵宿主细胞是一个有机的多步骤过程,有多种受体参与,其作用机理还不完全清楚,目前认为,病毒与宿主细胞表面受体之间至少存在4种相互作用关系。     

维生素E缺乏对雏鸡红细胞膜ATPase活性及唾液酸含量变化的影响

用低维生素E和添加不饱和脂肪酸的日粮饲喂雏鸡,建立维生素E缺乏实验动物模型。检测雏鸡红细胞膜ATPase活性和唾液酸(SA)含量。结果表明:维生素E缺乏组雏鸡红细胞膜ATPase活性和SA含量低于对照组,组间差异显著或极显著。提示维生素E对维持雏鸡红细胞膜结构和功能起重要作用。     

温度对新城疫灭活病毒血凝效价的影响

<正>新城疫病毒粒子呈球形,有包膜,病毒包膜上有2种糖蛋白突起和1种基质蛋白,其中一种糖蛋白突起在病毒中有血凝素和神经氨酸酶活性,称为血凝素神经氨酸酶(HN)。HN具有吸附作用,能够通过血凝素与敏感细胞表面的唾液酸受体结合,而使病毒吸附在细胞表面,也能够通过神经氨酸酶活性介导病毒粒子表面的唾液酸切除,防止因病毒粒子在细胞表面出芽时产生自我聚集[1]。血凝素(HA)在决定病毒     

N-羟乙酰神经氨酸研究进展

N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)是人类和鸡某些癌症疾病中的一种特异性标志物,主要作为Hanganutziu-Deicher抗原存在.人和鸡的正常细胞中不含有Neu5Gc,它在细胞间识别、黏附、炎症反应和肿瘤细胞转移中起重要作用.论文从Neu5Gc的生物合成、分布、细胞信号转导、免疫学特性和病理学意义等诸多方面多Neu5Gc进行综述,对Neu5Gc的全面认识将为预防肝癌、结肠癌等肿瘤疾病和一些病毒性传染病开辟一条新的诊断和防治途径.     

CRISPR/Cas9介导的ASGR1基因敲除猪制备

猪(Sus scrofa)内皮细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因之一.本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除的五指山小型猪基础上,利用规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNAl (single guide RNA1,sgRNA1),将sgRNA1与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞仪富集筛选带绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆.实验结果表明,PCR测序检测培养获得的41个单细胞克隆,37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90％,其中双等位基因敲除的细胞克隆30个,效率高达73％.选择4个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植,将早期重构胚移植到4头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪6头,Western blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达.对sgRNA1的13个潜在脱靶位点,分别设计引物进行PCR扩增和测序,结果显示没有脱靶现象.总之,本研究利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症,为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料.     

尼罗罗非鱼3种Siglecs like融合蛋白在COS-7细胞中的表达及其结合活性的初步研究

为获得尼罗罗非鱼Siglecs like融合蛋白,开展相关Siglecs like蛋白的功能研究,深入了解罗非鱼与无乳链球菌相互作用机制。本研究利用前期构建的3个含Siglecs like ORF的克隆质粒,PCR扩增获得Siglec-1、Siglec-4b和Siglec-14 like的膜外段序列,插入真核表达载体pc DNA3.1(+)h Ig G1 Fc中,双酶切、测序鉴定后转染COS-7细胞。q PCR、Western-blot对目的蛋白的表达进行检测;亲和层析法纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳检测纯化效率。ELISA检测融合蛋白与GBS的结合活性。测序结果显示,成功构建3个融合蛋白真核表达载体pc DNA3.1(+)h Ig G1 Fc-Siglecs like/Ex。检测结果显示,转染细胞中3个Siglecs/Ex-Fc融合蛋白在mRNA和蛋白水平都有高效表达,且过柱后的融合蛋白具有较高纯度;3个融合蛋白与罗非鱼源GBS的结合活性较对照组均有显著差异。研究表明,利用真核表达系统成功制备了具有较高纯度的尼罗罗非鱼3种Siglecs融合蛋白,且均有与GBS的结合活性。