高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株JXA1反向遗传平台的构建

【目的】为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)的结构功能和致病机理的研究奠定基础。【方法】运用反向遗传技术将HP-PRRSV JXA1株的全基因组分段克隆至改造过的低拷贝载体pOKq上,并在病毒基因组两端分别添加CMV启动子和BGH终止信号肽以及在病毒全基因组第510位核苷酸突变引入Fse I酶切位点,作为遗传标记位点。采取基于DNA-launched途径进行病毒拯救,并对拯救的病毒进行生物学特性分析。【结果】构建的PRRSV JXA1毒株的全长cDNA克隆具有感染性;成功拯救了病毒,命名为rJXA1;成功引入了拯救病毒的遗传标记;拯救病毒与亲本病毒的生长曲线相似,二者达到最高滴度的时间均为感染后72 h。【结论】成功构建了JXA1株反向遗传平台,为进一步研究HP-PRRSV的致病机理、基因功能以及新型疫苗研发奠定了基础。     

斜纹夜蛾精氨酸激酶基因的克隆及mRNA表达分析

利用RT-PCR和RACE技术获得了斜纹夜蛾精氨酸激酶基因的全长cDNA,命名为SlAK,其GenBank登录号为HQ840714。序列分析结果表明:该cDNA全长1373 bp,其中5′和3′UTR的长度分别为65和240 bp;其开放阅读框位于66～1133 bp,编码355个氨基酸。同源性分析结果显示,精氨酸激酶基因蛋白序列享有较高的同源性,该序列具有精氨酸激酶典型的酶活性部位氨基酸序列CPTNLGT、酶活性位点氨基酸和能形成离子耦合结构的氨基酸。SlAK基因在斜纹夜蛾幼虫的头部、中肠、脂肪体和体壁内均有表达,以在中肠内的表达水平最高;SlAK基因在斜纹夜蛾幼虫不同发育期的表达量不同,mRNA表达水平在3龄达到最高峰。     

脑心肌炎病毒VP1基因的克隆与原核表达

【目的】为获得重组脑心肌炎病毒VP1蛋白。【方法】利用RT-PCR方法对脑心肌炎病毒的VP1基因进行特异性扩增,并在pEASY-Blunt Zero载体中进行克隆。测序正确后,用Nde I和Hind III对重组质粒进行双酶切,将目的片段连接入原核表达载体pET-30a,提取质粒pET-30a-VP1,将质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达和纯化。【结果】重组的结构蛋白VP1以包涵体的形式存在,纯化后获得的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在31.5kD处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-30a-VP1。【结论】以原核系统成功表达脑心肌炎病毒VP1蛋白,进一步为犬的脑心肌炎病毒的血清学检测奠定基础。     

合作猪IFN-ε基因克隆及生物信息学分析

旨在克隆合作猪干扰素ε(Interferon epsilon,IFN-ε)基因,并对其结构和编码蛋白进行生物信息学分析,为进一步研究合作猪IFN-ε生物学功能提供参考。根据GenBank上公布的猪IFN-ε基因序列(登录号:NM_001105310.1)设计引物,PCR扩增及测序获得合作猪IFN-ε基因完整编码区序列(Coding sequence,CDS),并对其进行生物信息学分析。结果显示,合作猪IFN-ε基因编码区长582bp,编码193个氨基酸。该基因编码区序列与杜洛克猪、人、小鼠、黑猩猩、狗、瘤牛、蒙古野马、山羊和绵羊的同源性分别为98.4%、77.7%、56.8%、78.2%、76.5%、87.0%、85.5%、85.0%和86.0%;系统进化树结果表明,合作猪与瘤牛、蒙古野马、绵羊、山羊亲缘关系较近。此外,在合作猪IFN-ε基因CDS上共发现3个碱基突变,均为错义突变。氨基酸序列分析表明,合作猪IFN-ε蛋白分子式为C_(1027)H_(1630)N_(278)O_(290)S_(10),理论分子质量为22.83ku,等电点(pI)为8.43,属于碱性蛋白;平均亲水系数为-0.240,属于亲水蛋白质;IFN-ε蛋白无跨膜结构,存在信号肽序列,属于分泌型蛋白;IFN-ε蛋白只包含1个超家族保守结构域,即IFab结构域。二级结构分析表明,该蛋白中α-螺旋、无规则卷曲、β-转角和延伸链所占比例分别为61.66%、30.05%、3.11%和5.18%。     

黄瓜叶酸合成关键基因克隆与分析

【目的】分析黄瓜基因组中与叶酸合成代谢相关的基因数量、定位以及表达特征,对关键酶基因进行生物信息学分析与克隆,旨在为黄瓜叶酸合成调控研究奠定基础。【方法】根据已报道的拟南芥叶酸合成相关基因,利用黄瓜基因组数据库中9930_V3版本进行BLAST比对。利用MapChart绘制黄瓜染色体物理图谱并对基因定位。利用qRT-PCR分析这些基因在黄瓜果实发育不同时期和不同材料中的表达量。通过MEGA、WebLOGO、ExPASy等工具对关键酶基因进行生物信息学分析。通过PCR扩增对关键酶基因进行克隆,并测序分析基因的序列差异。【结果】同源比对获得19个黄瓜叶酸代谢相关基因,这些基因不均匀分布在黄瓜7条染色体上,且以Chr.4和Chr.5上分布最多。通过对其中11个调控叶酸合成的基因在测序黄瓜9930果实发育不同时期以及果实叶酸含量高低差异显著的2份材料的表达量分析,发现CsFPGS、CsHPPK/CsDHPS和CsDHNA 3个基因与果实叶酸含量变化趋势完全一致;CsADCS、CsADCL、CsDHNA、CsHPPK/CsDHFS、CsFPGS、CsDHFS等基因的表达量在2份材料中具有显著差异。通过对2个调控叶酸合成限速步骤的关键酶基因CsGCHI和CsADCS的蛋白序列及蛋白结构域分析,发现各物种中CsGCHI的同源基因均具有2个GTP_cyclohydroI结构域;CsADCS的同源基因均具有2个GATase结构域、1个Anth_synt_I_N结构域和1个Chorismate_bind结构域。它们在不同物种中高度保守,进化树分析亲缘关系近的物种聚类到一起。分别扩增黄瓜果实低叶酸含量自交系65G和高叶酸含量自交系02245中CsGCHI和CsADCS的同源基因,序列分析表明CsaV3_1G041250全长为3 012 bp,CDS序列长度为1 413 bp,3个SNP位点的突变导致了氨基酸序列的变异;CsaV3_7G026240全长为3 047 bp,CDS长度1 407 bp,序列无变异;CsaV3_5G036360全长7 941 bp,CDS序列长度为2 706 bp,序列无变异。【结论】鉴定出19个不均匀分布在7条染色体上的黄瓜叶酸代谢相关基因,基因CsFPGS、CsHPPK/CsDHPS 、CsDHNA和CsADCS是影响黄瓜果实叶酸含量变化、导致叶酸含量高低显著差异的关键基因,调控叶酸合成限速步骤的关键酶基因GCHI及ADCS功能相对保守,CsGCHI在65G、02245中有3个SNP位点的突变导致了氨基酸序列的差异。     

侵染广东连州葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子特征 及致病性分析

【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列（GenBank登录号：KX883801）设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F：CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R：TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1—3 511 nt,扩增引物序列为F：AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R：AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301—6 423 nt,扩增引物序列为F：GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGATTGCCCGTG/R：GGTGGAGATGCCATGCCGACCCTGGGCCCCTACCCGGGGAAAGG。将前后两段PCR产物通过同源重组的方法克隆到pCB301双元载体上,测序得到CGMMV-GDLZ分离物全长序列。利用CGMMV-GDLZ分离物全长序列在NCBI中进行Blast分析,然后通过MEGA7软件对CGMMV-GDLZ以及其他已经报道的CGMMV分离物进行系统进化树分析。将构建好的pCB301-CGMMV侵染性克隆注射接种本生烟验证其侵染性,然后再注射接种黄瓜、葫芦和西瓜的子叶,测定CGMMV-GDLZ分离物的致病性。【结果】RT-PCR结果证实,广东省连州市葫芦病样感染了CGMMV。CGMMV-GDLZ分离物全长序列为6 423 nt,编码4个蛋白,分别为129K复制酶（61—3 495 nt）、186K复制相关蛋白（61—5 007 nt）、运动蛋白MP（4 994—5 788 nt）和外壳蛋白CP（5 763—6 248 nt）。CGMMV-GDLZ核苷酸序列与CGMMV-eWT分离物（GenBank登录号：KY753928）同源性最高,为99.97%。系统进化树分析结果显示,CGMMV-GDLZ分离物与日本、韩国等东亚CGMMV分离物同属Group 1,在遗传距离上与山东、浙江和河南的CGMMV分离物最接近。pCB301-CGMMV侵染性克隆可以系统侵染本生烟,造成本生烟上部叶片出现皱缩、斑驳、凸起等症状,RT-PCR和Western blot进一步确认了侵染性克隆的侵染性。注射接种CGMMV-GDLZ分离物后15 dpi,葫芦和西瓜即可产生斑驳、花叶、突起、生长迟缓等症状,24 dpi时症状更明显。而15 dpi时,CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜上的症状不明显,与未接种对照植株几乎没有区别;将植株从控温接种室移入网室中,30 dpi时,黄瓜植株上部叶片开始出现斑驳和花叶,40 dpi时,症状已经非常明显。RT-PCR和Western blot检测进一步确认了上述结果。【结论】侵染广东省连州市葫芦的CGMMV-GDLZ分离物与山东、浙江和河南的CGMMV分离物很可能具有相同的传染源;CGMMV-GDLZ分离物可以侵染本生烟、黄瓜、葫芦和西瓜等作物,但对这些作物的致病性存在差异。     

茶树CsWRKYIIcs转录因子的克隆及功能分析

【目的】以‘陕茶1号’为材料,克隆CsWRKYIIcs转录因子并分析序列特征,了解其在不同组织和非生物胁迫下的表达模式以及转录活性,为深入研究茶树在逆境胁迫中的功能提供理论依据。【方法】根据茶树基因组数据库注释的WRKY序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术从‘陕茶1号’中扩增CsWRKYIIcs的cDNA序列,用生物信息工具分析序列的特点,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）研究基因的表达模式,用酵母试验验证其转录活性。【结果】获得9条CsWRKYIIcs的cDNA序列,开放阅读框长度分别为561、960、936、978、897、912、720、1 008和969 bp,分别编码186、319、311、325、298、303、239、335、322个氨基酸。除了CsWRKYIIc7缺少锌指序列外,其他CsWRKYIIcs均含有1个WRKY保守结构域和典型的C₂H₂型锌指结构。不同物种中的WRKYIIcs具有相似的保守基序,而茶树CsWRKYIIcs和拟南芥、葡萄等双子叶植物的WRKYIIcs氨基酸序列相似性更高。另外,CsWRKYIIcs启动子区域均预测到多个与非生物胁迫相关的顺式作用元件,意味着其可能参与非生物胁迫响应。qRT-PCR结果表明,9个CsWRKYIIcs在根和花中的表达量高于茎和叶,具有一定的特异性。同时,在干旱、ABA、高温和高盐胁迫下被不同程度的诱导表达,其中CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7的表达量变化显著,与推定的顺式作用元件结果相符。酵母试验表明9个茶树CsWRKYIIcs均具有转录激活活性。【结论】克隆获得9个茶树CsWRKYIIcs转录因子,它们参与了茶树对ABA、干旱、高温和高盐胁迫的响应,也可能发挥转录激活因子的调控作用。CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7可作为候选基因深入研究茶树的抗逆功能。     

绵羊Izumo1基因多态性及其与产羔数关联分析

为研究Izumo1基因多态性及与产羔数关系,本研究利用PCR和直接测序法对小尾寒羊和苏尼特羊的Izumo1基因DNA序列进行扩增、测序和BLAST分析,并和本课题组前期绵羊重测序数据进行比对,筛选出Izumo1基因SNP位点。同时,采用Sequenom MassARRAY~?技术进行基因分型,并对其SNP位点的基因型和等位基因频率在各群体中的分布进行研究。结果表明:小尾寒羊Izumo1基因DNA全长序列3 385 bp,苏尼特羊Izumo1基因DNA全长序列3 382 bp;筛选出8个Izumo1基因SNP位点,经过初步筛选,将在小尾寒羊、苏尼特羊、滩羊、萨福克羊、杜泊羊、草原藏羊这6个绵羊品种中位点分布没有差异的SNP位点排除,最终筛选获得的g.54412135AG和g.54412107CA 2个位点。Izumo1基因g.54412135AG位点在多羔和单羔绵羊品种中存在GG、GA和AA 3种基因型,G基因为优势等位基因;g.54412107CA在多羔品种中存在CC和CA 2种基因型,而在单羔品种中存在CC、CA和AA 3种基因型,C基因为优势等位基因,其基因型频率和基因频率在单、多羔绵羊群体间的分布差异均极显著(P0.01);群体遗传学分析得出g.54412135AG多态位点在6个品种中的多态信息含量(PIC)都属于低度多态(PIC0.25);g.54412107CA多态位点在杜泊羊中属于中度多态(0.25PIC0.5),在其他5个品种中都属于低度多态(PIC0.25),然而,关联分析发现Izumo1基因g.54412135AG和g.54412107CA位点的不同基因型与小尾寒羊不同胎次产羔数之间不存在显著关联(P0.05)。     

基于“药食同源”理论下功能保健蔬菜的栽培技术

综述药食同源植物紫背天葵和叶用枸杞的特征特性、营养成分及药用功效,并总结紫背天葵和叶用枸杞的高效优质栽培技术。     

拟南芥乙烯应答基因HLS1的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。【方法】构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。【结果】成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。【结论】成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。