小麦TaWRKY44基因的克隆、表达分析及功能鉴定

WRKY是植物特有的转录因子基因, 在植物对外界胁迫响应及生长发育的过程中发挥重要作用。本研究克隆了一个新的小麦WRKY转录因子基因TaWRKY44, 获得其全长cDNA, 其中开放阅读框长度为897 bp, 编码298个氨基酸。半定量RT-PCR的结果表明, TaWRKY44在叶片中表达水平较高, 并且受干旱和低温胁迫诱导表达。转基因功能分析结果表明, TaWRKY44的拟南芥超表达株系叶片变小, 叶柄缩短, 并且叶片细胞也明显小于野生型。另外, 转基因系对ABA、干旱和盐等胁迫处理的敏感性也高于野生型, 说明该基因可能作为一个转录抑制子参与逆境胁迫信号转导过程。     

青稞hblt14．2基因的克隆及功能分析

根据大麦blt14.2基因序列设计引物,用青稞基因组DNA为模板扩增低温反应基因的全长序列,命名为hblt14.2,在GenBank登录号为EF514912.该基因含470 bp,包括249 bp的开放阅读框、69 bp的5'非翻译区和152 bp的3'非翻译区,编码82个氨基酸残基,富含G1y、A1a、Leu和Va1,与其他冷诱导基因编码蛋白具相似性.与大麦bit14.2基因具98.9%同源性,所编码的蛋白存在2个氨基酸的差别.将hblt14.2基因连接CaMV35S启动子和NOS终止子后定向插入质粒pCAMBIA1301的多克隆位点中,构建植物表达载体pCAMBIA-BI-hblt,通过农杆菌介导转化烟草,并对转基冈烟草进行抗寒性检测.结果表明,青稞hblt14.2基因与植物的抗寒性有一定关系.     

应用T-DNA标签进行基因功能分析的步骤和方法

概述了应用T-DNA标签进行基因功能分析的步骤及获得突变体后标签基因的分离方法,对应用T-DNA标签进行基因功能分析研究具有一定的参考价值。     

日本血吸虫新基因Sj314C10的表达及功能分析

【目的】筛选新的高效抗日本血吸虫病疫苗。【方法】运用"电子cDNA文库"筛选法和快速cDNA末端扩增技术,对日本血吸虫新基因Sj314C10进行了克隆,构建了原核表达载体pET-28a(+)-Sj314C10,并探索了各种条件对表达蛋白的影响;用生物学软件初步预测了该基因的编码蛋白,用亲和层析法对表达产物进行纯化并完成了表达产物的抗原性检测及其对动物的保护性研究。【结果】表达产物约50 ku,为包涵体蛋白,温度I、PTG浓度和表达时相的改变对该包涵体蛋白的可溶性表达无显著影响;生物信息学分析表明,Sj314C10编码蛋白与杆状病毒凋亡抑制蛋白的重复结构域有78%的同源性,纯化蛋白抗原性良好;小鼠抗血吸虫尾蚴攻击试验显示,与佐剂对照组相比,蛋白免疫组获得了部分保护作用,这为血吸虫候选分子疫苗的研究增添了新内容。【结论】日本血吸虫Sj314C10基因得到了成功表达,所表达蛋白具有良好的抗原性,对小鼠具有一定的免疫保护作用。     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的功能分析

运用克隆的苎麻纤维素合成酶(BnCesA1)基因cDNA及植物表达载体pWM101,构建了35S启动子控制的苎麻BnCesA1基因核心区段反义融合表达载体(pWM-BnCesA),并通过根癌农杆菌介导法将其转化至模式烟草WS38,获得了转基因烟草.对转基因烟草植株进行的分子检测和初步组织学研究表明,转反义BnCesA1基因核心区段对纤维素的合成产生干扰,植株叶柄切片初生组织细胞较野生烟草松散,其基本组织细胞涨大,间隙也相应增大,证实BnCesA1基因的纤维素合成功能,表明BnCesA1基因在植物初生组织和次生组织的细胞壁合成中都发挥作用.     

小麦TaSPX1基因的克隆、表达及耐低氮逆境的功能研究

包含SPX、SPX-EXS、SPX-MFS和SPX-RING四个亚族的植物SPX基因家族在磷信号应答中发挥重要功能,但迄今对小麦的该家族基因成员功能了解尚少。本研究前期从小麦(Triticum aestivum)中鉴定得到一个SPX亚族成员基因TaSPX1 (GenBank No. Ak332300),亚细胞定位分析发现其定位于细胞核。对TaSPX1和来自小麦、拟南芥和水稻SPX家族的同源蛋白进行系统进化分析,结果表明,其与水稻SPX亚族的OsSPX1亲缘关系较近。应用RT-qPCR技术研究发现,TaSPX1的表达量在低氮胁迫下显著增加。构建烟草(Nicotianatabacum)过表达转基因系(overexpression lines, OE),应用MS营养液培养对野生型(WT)和OE株系OE3和OE4植株表型进行鉴定。发现在低氮胁迫下,OE3和OE4较WT表现明显的生长优势,植株鲜重、根重和叶面积显著增加;包括光合速率、胞间CO2浓度、气孔导度和蒸腾速率在内的光合参数,以及氮含量、可溶性糖、可溶性蛋白和叶绿素含量也都较WT显著增加。对氮吸收和同化相关基因的表达和酶活性测定结果表明,...     

胶孢炭疽菌致病相关基因Plv2功能分析

胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的橡胶树炭疽病是橡胶树三大叶部病害之一,严重威胁着橡胶树的生长。本研究从构建的胶孢炭疽菌RC178 T-DNA突变体库中筛选获得一株致病力明显减弱的突变菌株T1103,其T-DNA为单拷贝。采用TAIL-PCR克隆了该突变体T-DNA插入位点的侧翼序列,通过比对胶孢炭疽菌全基因组序列,发现该TDNA插入位点所在的序列包含一个5 400 bp的基因,将其命名为Plv2。Plv2基因包含3个外显子,编码一个假定的甾醇C-24甲基转移酶。敲除野生型菌株RC178中的Plv2,发现敲除突变体与T1103的致病力表现基本一致,由此推测Plv2基因为致病相关基因。     

西瓜噬酸菌ftsH基因功能分析

 AAA ATPase (ATPase associated with diverse cellular activities) 在西瓜噬酸菌的多种生命过程中发挥重要作用。AAA家族中的FtsH蛋白(filamentation temperature-sensitive H)是由ftsH基因编码的,参与生长、致病、环境应激反应、膜内在蛋白质量控制等过程的蛋白,但其在西瓜噬酸菌中的作用尚未明确。本实验以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象,通过构建基因缺失突变体,测定致病力等各项表型以及突变株中致病相关基因和其他AAA ATPase基因的表达量,初步探索西瓜噬酸菌中ftsH的功能,为FtsH蛋白的功能研究奠定基础。结果表明,ftsH缺失显著降低菌株致病力、运动能力、生物膜形成能力、生长能力和环境胁迫耐受能力,不影响烟草过敏性反应,显著影响西瓜噬酸菌致病相关基因、AAA ATPase基因以及热激转录因子σ³²的表达量。这表明ftsH基因的功能与西瓜噬酸菌的致病性和环境耐受性密切相关。     

产酶溶杆菌OH11菌株胞外酶调控相关基因ctp的克隆及功能的初步分析

利用mariner转座子对产酶溶杆菌Lysobacter enzymogenes OH11进行转座诱变,构建菌株OH11的突变体文库.筛选到1株4种胞外酶(蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶)产生均减少的突变株D-11.通过亚克隆,鉴定转座子的插入位点,涉及1个羧基末端蛋白酶(carboxy-terminal protease)编码基因ctp.通过同源重组的方法对该基因进行敲除,对缺失突变体Δctp表型分析发现:(1)Δctp与野生型OH11在营养丰富型(2YT)与营养缺陷型(MMX)培养基中生长速率基本一致;(2)Δctp降低了蛋白酶、纤维素酶和β-1,3-葡聚糖酶的产生,但不影响几丁质酶的产生;(3)Δctp生物膜的产生量明显减少.研究还表明,突变体基本不改变其对油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani和辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici的拮抗能力.互补菌株均恢复了野生型的相关功能.     

枣树2-半胱氨酸氧化还原酶基因Zj2-CP在干旱和盐胁迫下的功能分析

【目的】研究枣树2-半胱氨酸氧化还原酶基因(2-Cys peroxiredoxins, Zj2-CP)的功能,为其在枣树抗逆基因工程改良中的利用奠定基础。【方法】以‘辣椒枣’(Ziziphus jujuba‘Lajiaozao’)组培苗为研究对象,通过实时荧光定量PCR技术分析目的基因在盐胁迫及PEG胁迫条件下的表达模式,利用农杆菌介导法将本实验室已构建的植物表达载体PEZR(K)-Zj2-CP-LNY转入拟南芥,激光共聚焦显微镜进行目的基因的亚细胞定位,同时对转基因植株进行高盐和干旱胁迫处理,验证其抗逆功能。【结果】实时荧光定量PCR分析表明‘,辣椒枣’组培苗中,Zj2-CP能够被不同浓度的PEG和盐胁迫诱导表达,暗示该基因可能对枣树抗旱性和耐盐性具有重要的作用。转Zj2-CP基因的拟南芥转化株系的茎和叶表皮细胞的细胞膜和细胞质以及根的细胞膜中均检测到Zj2-CP存在。在盐胁迫处理下,转Zj2-CP基因的拟南芥的幼苗存活率显著低于野生型;在干旱胁迫处理下,转Zj2-CP基因植株主根的长度显著低于野生型。【结论】与野生型拟南芥相比,过表达Zj2-CP基因的拟南芥增加了对干旱和盐胁迫的敏感性,我们推测Zj2-CP参与植物干旱和盐胁迫响应。