小熊猫源犬瘟热病毒全基因序列的克隆及序列分析

本研究对军事兽医研究所病毒二室分离驯化后的小熊猫源犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)基因组进行全序列测定,并对其基因组特征及H基因遗传稳定性进行比较分析。根据GenBank公布的犬瘟热病毒全长基因组序列设计合成17对特异性引物,以小熊猫源犬瘟热病毒总RNA为模板,RT-PCR进行分段扩增,并克隆到pEASY-Blunt Simple载体中,经测序、拼接获得全长cDNA序列。结果显示,小熊猫源犬瘟热病毒全基因序列与GenBank登录号分别为AF014953、AY445077、AY542312、AY466011、AY386316、AF164967、EU716337、EU726268、AY443350、AB474397、GU138403和AY649446的12个不同毒株全基因序列的同源性分别为86.6%、92.4%、92.5%、92.5%、94.3%、96.3%、95.9%、87.1%、94.5%、92.3%、87.4%和94.6%,与标准强毒株A75/17株(AF164967)的亲缘关系最近,全基因同源性达96.3%,但与疫苗株Onderstepoort(AF014953)亲缘关系相对较远,同源性为86.6%。小熊猫源犬瘟热病毒H基因与其他不同地区具有代表性的30株CDV进化树分析显示,小熊猫源犬瘟热病毒属于Asia Ⅰ型,H蛋白中309－311位氨基酸残基所形成的潜在糖基化位点,为疫苗株没有而野毒株所共有的,并且可能与病毒的免疫原性有关。因此,致弱的小熊猫源CDV在预防免疫的针对性上可能强于已有的疫苗株。     

猬迭宫绦虫裂头蚴线粒体nad1基因部分序列的多态性研

从湖南省4个不同地区的黑斑蛙大腿肌肉中采集猬迭宫绦虫裂头蚴作为研究对象,用引物Nad1u及Nad1d扩增猬迭宫绦虫裂头蚴的nad1基因片段,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,同时利用DNAStar 5.0中的MeGalign程序进行同源性分析。结果显示猬迭宫绦虫裂头蚴nad1序列均为570 bp。研究结果为猬迭宫绦虫裂头蚴进一步的分类、鉴定和遗传变异研究奠定了基础。     

利用ITS序列和trnL-F序列探讨赖草属6个物种的系统发育关系

本研究克隆了赖草属6个物种Leymus karelinii,L.angustus,L.racemosus,L.arenarius,L.triticoides和L.ambiguus的ITS序列和trnL-F序列,并选用3个新麦属物种的ITS序列和27个小麦族二倍体物种的trnL-F序列,均以Bromus catharticus为外类群,用最大简约法构建系统发育树。结果发现:不同组的赖草属物种分别聚在一起;赖草属植物与新麦草属植物亲缘关系较近;新麦草属植物是这6个赖草属物种的母本来源。     

一例猪繁殖与呼吸综合征病的诊断

河南某地区一猪场肥猪群出现严重呼吸道症状,母猪出现流产现象,病理剖检显示猪肺门淋巴结肿大,猪肺脏呈现间质性肺炎病变,边缘出现实变,临床症状显示疑似猪繁殖与呼吸综合征病(PRRS)阳性。为了确诊,从肺脏病变部位采集病料,提取RNA进行RT-PCR扩增,最后进行序列的遗传进化分析,结果显示扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因(ZMD),进化分析显示扩增出的序列与NADC30和NADC30-like序列位于同一分支,序列比对显示ZMD与欧洲型LV的核苷酸同源性为61.4%;和美洲型VR-2332毒株的同源性为85.1%;与经典疫苗株CH-1a核苷酸同源性为87.1%;和致病性很高的毒株JXA1核苷酸同源性为85.6%;与NADC30毒株核苷酸同源性最高,为95.9%。这些试验结果表明引起猪只发病的病原为PRRSV,毒株类型为NADC30-like毒株。     

鸡传染性囊病病毒青岛分离株VP2基因的克隆及序列分析

为了克隆传染性囊病病毒青岛分离株(IBDV-QD)的VP2 基因及对其高变区序列进行分析,首先根据GenBank上已经发表的传染性囊病病毒(IBDV)UK661株的核苷酸序列,设计并合成了一对特异性的扩增IBDV-QD VP2 基因的引物.以IBDV-QD株基因组为模版,利用RT-PCR技术扩增出长约1.5 kb的基因片段,将其连接到pGEM-T-Easy载体上.经酶切分析、PCR鉴定及核苷酸序列测定,成功获得该分离株VP2基因的重组质粒.将IBDV-QD株VP2基因的高变区核苷酸序列及推导出的氨基酸序列与GenBank中公布的14株IBDV相应序列应用软件进行同源性比较,并构建系统进化树.同源性比较和进化树分析表明,IBDV-QD与IBDV超强毒株(vvIBDV)关系最近,与标准强毒株、弱毒株、变异株相差较远;并且我国不同地区的vvIBDV存在差异,这为我国传染性囊病的流行病学调查奠定了基础.     

牦牛Hepcidin基因的克隆与序列分析

根据GenBank中公布的普通牛Hepcidin基因序列(登录号为XM-589792.3)设计1对特异性引物.采用RT-PCR技术从牦牛肝脏组织总RNA中扩增出Hepcidin基因的编码序列并进行测序分析,同时构建Hepcidin蛋白物种进化树.结果显示,经克隆获得牦牛Hepcidin基因322 bp的cDNA序列(GenBank登录号为EU863791),含289 bp的开放阅读框,编码82个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽;预测Hepcidin蛋白分子质量和等电点分别为8.88 ku和9.24;与已知普通牛Hep-cidin序列的同源性达99%,不同物种Hepcidin蛋白具有高度的保守性,Hepcidin蛋白物种进化树符合物种进化规律.本研究为Hepcidin基因cDNA全长克隆及基因功能研究奠定了重要基础.     

番鸭细小病毒弱毒株VP2基因的序列分析

将番鸭细小病毒强毒株MDPV－Q经番鸭胚传代，获得致弱株MDPV－26，应用PCR技术扩增MDPV－26株的VP2基因片段，将扩增后的VP2基因重组到pMD 18-T质粒载体上，并对插入片段进行序列测定，将测定结果及由该结果推导的氨基酸序列分别与MDPV－Q株及国外已发表的MDPV相应序列进行同源性比较及分析，结果表明，MDPV－26与强毒株MDPV－Q的VP2基因序列及与国外分离株均具有很高的同源性。     

猪瘟病毒辽宁株E2蛋白部分基因片段的序列分析

应用RT-PCR方法对辽宁地区8份猪瘟临床病料进行了E2蛋白部分基因片段扩增，其中有5份病料扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳获得大小约为210bp的目的基因片段。经对目的基因片段回收纯化后进行核苷酸序列测定，并与国内外发表的18株猪瘟病毒株的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较表明，所分离的5株猪瘟病毒株核苷酸序列及氨基酸序列与C1W、C2W等8个毒株的同源性较高，而与国内的疫苗株和强毒株的同源性则较低，基因型差异比较明显，并不归属于同一个基因亚群。本研究通过对E2基因片段扩增以及相应的核苷酸序列的氨基酸序列分析，揭示了本地区猪瘟病毒的分子流行病学背景。     

大熊猫犬冠状病毒部分S基因的克隆与全S基因序列分析

从重庆某动物园死亡的大熊猫肝脏中分离到一株病毒，经鉴定为犬冠状病毒（命名为CCV DXMV）。本实验根据CCV K378和CCV Insavc-1株基因序列设计合成了普通PCR引物SF1-SR1和SF2-SR2，以及半套式引物SF3-SR3、SR13、SF13、SF4-SR4和SF14，分段扩增了CCVDXMV株部分S基因，得到了368bp、792bp、737bp、1178bp和985bp5个基因片段。将纯化的RCR产物分别克隆到pGEM—T载体中，通过筛选和鉴定，获得了5个阳性重组质粒。将重组质粒送生物公司测序，将测得的基因序列与先前测定的该株病毒部分S基因序列，拼接成全S基因序列，并与其它株CCV及TGEV HN2002和FIPV79—1146株的S基因序列进行分析比较，绘制进化树。结果表明，该株病毒与CCV K378株的同源性最高，达到99．4％；而与CCV 23／03株的同源性最低，为56．9％；与FIPV和TGEV分别有90．4％和82．1％的同源性。     

鸡病毒性关节炎病毒C-98分离株S1基因的克隆与序列分析

提取鸡病毒性关节炎病毒（AVAV）内蒙古分离株（C-98株）总RNA，参考GenBank中禽呼肠孤病毒（ARV）S1133株S1基因序列设计了2对引物，应用RT—PCR技术扩增了病毒S1基因，将S1基因cDNA克隆到pGEM—T Easy载体后测序。将测定序列拼接后与参考毒株ARV-176、ARV-138、ARV-S1133、MDRV—YJL的S1基因序列进行了比较。结果显示，AVAV C-98分离株的S1基因与强毒株ARV-176株的同源性最高，达99．9％；与MDRV—YJL的同源性为99．3％，与弱毒疫苗株ARV—S1133的同源性也达97．9％；与ARV-138株的同源性最低，为81．2％。表明，AVAVC-98株与参考毒株的差异较小，与疫苗株ARV-S1133有很高的同源性。