冬小麦幼苗中玉米赤霉烯酮的免疫组织学定位

应用免疫组化方法结合共聚焦激光扫描显微技术,研究了小麦春化幼苗的根尖和茎尖中玉米赤霉烯酮的存在及分布。结果表明,玉米赤霉烯酮在根中集中存在于根尖最前端约1mm长的区域,即根冠和分生组织区,至伸长区逐渐减少。在茎尖中,生长锥下方的分蘖节中的玉米赤霉烯酮含量很高,与生长锥相邻的叶原基内侧也有较高量的分布。顶端分生区的荧光反应较弱,侧芽(分蘖)原基呈负反应。     

玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA检测方法的初步建立

为了研究玉米赤霉烯酮的间接竞争ELISA检测方法,试验采用牛血清白蛋白与玉米赤霉烯酮的耦联物(ZEN-BSA)做包被抗原,标准玉米赤霉烯酮(ZEN)做竞争抗原,以制备的可稳定分泌抗ZEN的单克隆抗体为基础,初步建立了ZEN间接竞争ELISA检测方法。结果表明:间接竞争ELISA检测方法线性范围为0.363 2～78.985 2μg/L,最低检测限为0.231 9μg/L;曲线回归方程为y=68.711-25.666x,其中R2=0.987 1,批内平均变异系数为3.10%,批间平均变异系数为6.26%,与相似毒素的交叉反应率均小于0.01%。说明建立的检测方法可以用于ZEN的检测。     

高效液相色谱-二极管阵列法对中药中玉米赤霉烯酮毒素的检测效果

为建立简便易行、快速准确检测中药中玉米赤霉烯酮毒素的方法,对107个中药样品中的玉米赤霉烯酮毒素采用高效液相色谱-二极管阵列检测法进行测定。结果表明:玉米赤霉烯酮毒素在5～1 000ng/mL范围内线性关系良好,检测限(LOD)为25.7μg/kg,回收率82.4%～92.8%,RSD2.4%～8.8%。高效液相色谱-二极管阵列检测法简便快速、通用性强、结果准确可靠,可满足不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素检测的需要。     

A novel mycotoxin purification system using magnetic nanoparticles for the recovery of aflatoxin B1 and zearalenone from feed

In this study, we developed a novel tool for purifying two mycotoxins, aflatoxin B1 (AFB1) and zearalenone (ZEN), in feed. This system utilized monoclonal antibodies (mAbs) against AFB1 and ZEN, and magnetic nanoparticles (MNPs). Among ten MNPs with different diameters and functional groups, a 100-nm diameter MNP (fMA) conjugated to an amine group (-NH₂) was found to be optimum for coupling with mAbs. The optimal mAb concentrations for coupling to the fMA along with mycotoxin purification capacities of the fMA-mAb conjugates (fMA-AFB1 and fMA-ZEN) were determined. A comparison of mean recovery rates (from corn and product X feed) between the fMA-mAb conjugates and immunoaffinity columns (IAC-AFB1 and IAC-ZEN) showed that the rate for fMA-AFB1 (90~92% and 81~88%) was higher (p > 0.05) than that of IAC-AFB1 (81~84% and 72~78%) for AFB1 (5, 10, 15 ng/mL), and the rate for fMA-ZEN (99~100% and 92~94%) was significantly higher (p < 0.01) than that of IAC-ZEN (86~88% and 81~88%) for ZEN (10, 25, 50 ng/mL) except at a concentration of 10 ng/mL, demonstrating the remarkable purification efficiency of the novel fMA-mAb method. Additionally, mycotoxin purification was much faster using our novel method (approx. 5 min) than the IAC-based technique (> 30 min). This study suggests that the novel purification system we developed would be a useful tool for monitoring and regulating mycotoxin contamination in feed, and replace IAC methods.     

运用计算机分子对接技术初步探究粮食中玉米赤霉烯酮及其降解产物的雌激素效应

计算机分子对接是模拟受体和底物之间通过能量匹配和几何匹配而相互识别的过程。其被广泛运用于虚拟筛选活性物质以及初步判断分子活性和毒性等领域,并对实体分子活性毒性实验起到了重要的指导作用。本实验是通过利用计算机分子对接软件discovery studio 3.1client,以强雌激素活性的17β雌二醇作为阳性对照,对粮食中的主要毒性物质-玉米赤霉烯酮及其两种降解产物α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的雌激素活性进行初步分析。实验结果表明,玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇对于雌激素的两种特异性受体α雌激素受体以及β雌激素受体的结合能量分别为-38.9894kcal/mol、-41.937kcal/mol、-27.6144kcal/mol,软件对接评分分别为:玉米赤霉烯酮113.570和106.956;α-玉米赤霉醇94.0647和72.6476;β-玉米赤霉醇115.28和107.458;计算机对接实验表明,这三种物质均有很强的雌激素活性,并且活性大小为:α-玉米赤霉醇玉米赤霉烯酮β-玉米赤霉醇。     

咖啡酸对玉米赤霉烯酮诱导小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用

卵巢颗粒细胞通过与卵母细胞相互作用及其自身分泌作用为卵泡的形成和发育成熟提供特殊的微环境。多种有害刺激可引起颗粒细胞凋亡和代谢失调从而降低卵母细胞质量,对胚胎的形成产生负面影响。玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）是畜禽养殖业中常见的造成卵巢颗粒细胞损伤的霉菌毒素,且缺少有效治疗药物。因此,本试验用ZEA造成小鼠卵巢颗粒细胞损伤,探究咖啡酸对ZEA诱导的小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用。通过机械法分离小鼠卵巢颗粒细胞;运用间接免疫荧光法对分离出的细胞进行鉴定;使用MTT法测定咖啡酸对正常小鼠卵巢颗粒细胞活性的影响;选取200、100和50 μg·mL^-1咖啡酸分别与ZEA共处理颗粒细胞,同时设置细胞对照组和ZEA模型组,24 h后显微镜观察细胞形态及贴壁情况,MTT法检测细胞活力;qRT-PCR技术检测caspase-3 mRNA的表达;Western blot检测cleaved-caspase-3和cleaved-PARP蛋白水平。结果发现,FSHR阳性染色大量出现在试验组细胞胞浆中,提示分离到的细胞是小鼠卵巢颗粒细胞;咖啡酸对卵巢颗粒细胞没有毒性作用且细胞活力均在90%以上;与空白对照组细胞相比,ZEA组细胞体积较小,贴壁较差,细胞间隙增大,细胞活力显著降低（P<0.001）,caspase-3 mRNA相对表达量以及cleaved-caspase-3和cleaved-PARP蛋白表达水平显著升高（P<0.001）,而给予咖啡酸处理后细胞间隙减小,贴壁紧密,细胞活力显著升高（P<0.001）,显著降低ZEA诱导的caspase-3 mRNA含量增加（P<0.001）,显著降低凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表达（P<0.001）。本研究发现,咖啡酸可通过抑制ZEA诱导的细胞凋亡,恢复颗粒细胞活性。     

玉米赤霉烯酮对后备母猪子宫和卵巢抗氧化和炎症指标及相关基因表达的影响

试验旨在研究玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）对后备母猪子宫和卵巢抗氧化和炎症指标及相关基因表达的影响。选择胎次和体重（（23.20±0.68）kg）相近的长×大二元后备母猪48头,随机分为4组,每组设12个重复,每个重复1头母猪。对照组（CON组）饲喂基础饲粮,试验组（T1、T2、T3组）饲喂在基础饲粮中分别添加200、800、1600 μg·kg^-1ZEA的试验饲粮。预试期7 d,正试期40 d。结果如下：1）与CON组相比,T3组血清T-AOC和SOD活性显著降低（P<0.05）,MDA水平显著升高（P<0.05）。2）与CON组相比,子宫组织中,T2和T3组T-AOC活性显著降低（P<0.05）,T3组SOD活性极显著降低（P<0.01）,卵巢组织中,T3组T-AOC活性、T2组GSH-Px和SOD活性显著降低（P<0.05）,T3组MDA水平显著升高（P<0.05）。3）与CON组相比,T2组血清TNF-α和IL-4水平显著升高（P<0.05）,T1~T3组血清IL-10水平显著降低（P<0.05）。4）与CON组相比,子宫组织中,T2组IL-1β水平显著升高（P<0.05）,T1和T3组IL-10水平显著降低（P<0.05）。卵巢组织中,T2组TNF-α水平显著升高（P<0.05）,T1~T3组IL-4水平显著升高（P<0.05）。5）子宫组织中,T3组Cu/Zn-SOD mRNA的相对表达显著低于CON组（P<0.05）,T2组IL-1β mRNA的相对表达显著高于CON组（P<0.05）。6）卵巢组织中,T3组GSH-Px mRNA的相对表达显著低于CON组（P<0.05）,T2组IL-1β mRNA的相对表达显著高于CON组（P<0.05）。综上所述,ZEA能通过抑制SOD和GSH-Px的表达与合成,降低后备母猪子宫和卵巢的抗氧化性能,并引起氧化应激。ZEA能通过促进TNF-α和IL-1β表达与合成引起子宫和卵巢的炎症反应,抑制IL-10的表达与合成从而抑制两组织的抗炎反应。     

自然越冬过程中冬小麦体内玉米赤霉烯酮含量的变化

用放射免疫分析法首次测定了冬小麦自然越冬期间不同部位中玉米赤霉烯酮含量。发现越冬冬小麦的分蘖节中玉米赤霉烯酮含量呈双峰曲线,10月底和1月初分别出现最高值。根尖中的含量与分蘖节中的含量变化基本同步,但前期无明显峰值。在1月初根尖和分蘖节同时出现峰值时,根尖中的含量约为分蘖节中含量的10倍。02-10以后,各部位含量的均降至较低水平。说明冬小麦体内玉米赤霉烯酮含量变化与春化过程密切相关。鉴于根尖和分蘖节含量远高出其他部位,推测分生组织是玉米赤霉烯酮生物合成的活跃部位。     

原花青素对玉米赤霉烯酮诱导牦牛颗粒细胞氧化损伤的保护作用研究

旨在探究原花青素（procyanidins,PC）在玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）诱导牦牛颗粒细胞产生氧化损伤后,对颗粒细胞生长增殖、抗氧化性以及激素分泌的影响。本试验选取3～5岁的健康牦牛（n=3）,完成卵巢颗粒细胞的分离培养,并通过免疫荧光染色鉴定颗粒细胞纯度。通过CCK-8法分别比较不同浓度ZEA （0（对照组）、5、10、20、40、60、80和100 μmol·mL^-1）、不同浓度PC （0（对照组）、0.05、0.5、2.5、5、10、50和100 μg·mL^-1）以及50 μmol·mL^-1 ZEA+5 μg·mL^-1 PC联合处理对牦牛颗粒细胞活性的影响。通过ELISA法检测对照组（未添加ZEA及PC）、50 μmol·mL^-1 ZEA组和50 μmol·mL^-1ZEA+5 μg·mL^-1PC联合处理组牦牛颗粒细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）以及雌二醇（E₂）水平。采用实时荧光定量PCR法检测不同组颗粒细胞中部分增殖生长、凋亡、抗氧化及E₂合成相关基因的表达水平。结果显示,本研究所分离培养得到的细胞表达颗粒细胞标志蛋白FSHR,具有较高的纯度,可以满足后续试验要求。添加不同浓度ZEA后,颗粒细胞活力随着ZEA浓度的升高而显著降低（P<0.05）。在一定浓度范围内（0~5 μg·mL^-1）,随着浓度的上升,PC对颗粒细胞的活力有显著提高作用（P<0.05）,且在浓度为5 μg·mL^-1时对细胞活力的提高作用最明显。与ZEA处理组相比,ZEA与PC联合处理后颗粒细胞的数量增加且细胞活力极显著提高（P<0.05）,颗粒细胞增殖生长相关基因PCNA和IGF-Ⅱ 以及抗凋亡相关基因XIAP和BCL-2的表达显著上调（P<0.05）。相反,促凋亡相关基因BAX和CASP3的表达显著下调（P<0.05）。同时,ZEA+PC联合处理后能显著降低牦牛颗粒细胞活性氧水平并促进颗粒细胞分泌E₂（P<0.05）,颗粒细胞中的抗氧化相关基因SOD2、GPX1及CAT和E₂合成相关基因STAR、CYP11A1及HSD3B的表达量显著上调（P<0.05）。上述结果表明,PC可提高经ZEA处理后颗粒细胞的生长增殖能力,上调颗粒细胞的活力,提高抗氧化能力,降低ROS水平以及提高E₂的分泌水平。综上所述,PC对ZEA诱导的牦牛颗粒细胞氧化损伤有一定保护作用。本研究为ZEA毒性的防治和畜牧业生产中PC的应用提供了一定的研究数据和理论支持。     

猪胃肠道食糜中黄曲霉毒素B_1和玉米赤霉烯酮检测方法的改进及其在霉菌毒素吸附剂吸附效果评价中的应用

本试验旨在建立测定猪胃和小肠食糜上清液中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮含量的高效液相色谱(HPLC)法,并利用该方法评价霉菌毒素吸附剂分别在不同介质中对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的吸附效果。为消除食糜上清液中复杂组分对目标毒素检测的干扰,本试验对毒素提取方法、液相色谱的检测波长设置和流动相组成进行了优化。利用单浓度体外吸附试验评价了4种霉菌毒素吸附剂分别在水、猪胃和小肠食糜上清液介质中对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的吸附效果。结果表明:1)反应上清液经过1次正己烷和3次二氯甲烷提取,荧光激发波长和发射波长在0~9 min和9~14 min分别设定为360、440 nm和235、418 nm,乙腈/水流动相中乙腈比例控制在40%~60%时,本试验采用的HPLC仪对1.00~10 000.00 ng/m L黄曲霉毒素B1和20.00~5 000.00 ng/m L玉米赤霉烯酮具有良好的分离定量效果,线性相关系数分别为1.000和0.999;检出限分别为0.16和2.00 ng/m L;黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮日内精密度相对标准差分别为2.37%、4.50%;日间精密度相对标准差分别为2.74%、8.84%。黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮标准添加回收率分别为89.1%~110.3%、98.7%~104.1%。2)自制霉菌毒素吸附剂样品P3、M3和市场采购的霉菌毒素吸附剂产品Y1、Y2在猪胃食糜上清液介质中对黄曲霉毒素B1的吸附率依次为72.10%、84.18%、83.17%和66.01%;在猪小肠食糜上清液介质中的吸附率依次为78.15%、88.08%、88.12%和67.34%。4种吸附剂在胃食糜上清液介质中对玉米赤霉烯酮的吸附率依次为85.35%、18.41%、16.20%和12.98%;在猪小肠食糜上清液介质中的吸附率分别为39.75%、25.15%、21.40%和24.85%。综上,本试验建立的HPLC法可同时测定猪胃和小肠食糜上清液中的黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮,检测限和检测范围满足我国《猪饲料卫生标准》的要求。该方法可用于评价霉菌毒素吸附剂猪生理体液条件下对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的吸附效果。