烟草和水稻中水稻条斑病菌过敏反应激发子Ssb_x互作因子的鉴定

【目的】水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)中单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA-binding protein,SsbX)通过病原菌III型分泌系统(type-III secretion system,T3SS)分泌,在非寄主植物烟草上产生过敏反应(hypersensitive response,HR),研究旨在明确SsbX激发烟草产生HR的机理。【方法】将水稻条斑病菌RS105菌株注射水稻和烟草叶片,应用CreatorTM SMARTTM cDNA文库构建试剂盒构建水稻和烟草cDNA文库,借助pGADT-Sfi AB载体上特殊酶切位点SfiⅠ,酶切检测水稻和烟草cDNA文库质量;以SsbX为诱饵,通过酵母双杂交技术(Y2H)从水稻和烟草cDNA文库中筛选在SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His培养基上能够生长的阳性克隆;并利用β-gal试验验证阳性克隆;序列测定后,使用MEGA 4序列分析软件,并利用邻位相连法(neighbor-joining,NJ)对筛选获得的互作因子进行同源序列和系统进化树分析;利用荧光双分子互补试验(BiFC)于488 nm处黄色激发光和520—550 nm透射光、20×物镜下,在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP5-II)观察SsbX与烟草和水稻中互作因子的互作位点。【结果】水稻和烟草cDNA文库构建和质量检测结果显示,随机挑选20个克隆中水稻来源的cDNA插入在pGADT-Sfi AB载体上,平均片段大小1.0kb;随机挑选20个克隆中烟草来源的cDNA均插入在pGADT-Sfi AB载体上,平均片段大小1.2 kb,说明水稻和烟草的cDNA文库构建质量较好;Y2H和β-gal试验结果显示,SsbX可与烟草和水稻的ADF2(actin-depolymerization factor 2)蛋白互作,使酵母AH109能够在SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His平板上生长,并且β-gal染色显示为蓝色。水稻Os ADF2编码139氨基酸,蛋白质分子量为15.9 k D,而烟草Nb ADF2编码137氨基酸,蛋白质分子量为15.kD,两者同源性达69.02%。同源性以及系统进化树分析显示,植物中ADF2广泛存在,同源性高达60%以上。双子叶植物烟草和拟南芥的ADF2同源性最高,相似性达69.05%;单子叶禾本科植物水稻和狗尾草的ADF2同源性最高,相似性为88.81%。BiFC试验结果显示,在488 nm波长的激光共聚焦显微镜下,仅SsbX和Os ADF2以及SsbX和Nb ADF2共同存在时,可在烟草细胞膜上显示黄色荧光,与阳性对照显示黄色荧光一致,说明SsbX可与Os ADF2或Nb ADF2互作,互作位点发生在植物细胞膜上。【结论】通过T3SS分泌的水稻条斑病菌中的SsbX,在植物细胞膜上与ADF2互作,从而激发植物的免疫性。这为进一步揭示SsbX如何激发植物产生HR的机制提供了依据。     

固定化酵母菌发酵产酒精作用的研究

[目的]探索固定化酵母发酵产酒精的效果。[方法]通过比较固定化酵母与游离酵母的酒精度、酸度和糖锤度,分析它们在产酒精、酸度和糖锤度变化方面的差异。[结果]固定化酵母在发酵过程中初发酵时间比游离酵母初发酵时间短,发酵的速度比游离酵母发酵的速度快。在12 d的发酵时间里,固定化酵母发酵产酒精比游离酵母发酵产酒精的酒精度高将近50%。固定化酵母发酵液的酸度变化比游离酵母的酸度变化小,发酵液的酸度比较稳定,对产酸杂菌的抵抗能力更好。固定化酵母发酵比游离酵母发酵更彻底,时间更短。[结论]固定化酵母发酵比游离酵母发酵更优越。     

巨峰葡萄自然发酵不同阶段酵母菌的组成及差异分析

采集巨峰葡萄发酵不同阶段的发酵液,通过酵母菌的分离、纯化、WL培养基的鉴别培养、表型性状的聚类分析以及显微细胞形态观察,对酵母菌进行初步的表型分群,挑选不同表型群的代表菌株进行DNA的提取以及26S rDNA D1/D2基因扩增和测序分析。共得到64株酵母菌,经过对获得酵母菌菌株的表型鉴定得到14个表型群,通过26S rDNA基因测序、比对,酵母菌最终鉴定为3个不同的酵母菌种群,分别为假丝酵母、路氏类酵母和酿酒酵母。其中发酵前期包含的酵母菌种群是假丝酵母(64%)和路氏类酵母(36%);发酵中期包含假丝酵母(10%)、路氏类酵母(5%)和酿酒酵母(85%);发酵后期则包含路氏类酵母(43%)和酿酒酵母(57%)。结果表明,发酵不同阶段的优势酵母菌种群是存在差异的,酿酒酵母在发酵的中后期均占优势,假丝酵母仅在发酵的前中期存在且只在前期占优势,路氏类酵母在发酵的各个时期均有发现,但发酵后期占比最高。     

5株海洋酵母的鉴定及耐盐性分析

从海南洋浦近海分离到5株海洋酵母,利用生理生化结合ITS序列分析,分别鉴定为解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、红酵母(Rhodotorula sp.)、季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)。耐盐性分析表明,在NaCl浓度为3%时,5株酵母的生长均没有受到影响。     

改进的双酶法工艺下酵母培养时间与发酵时间及营养物对木薯出酒率的影响

在木薯生产乙醇的液化糖化阶段,双酶法在纤维素酶、葡聚糖酶等辅助下,可以提高还原糖的得率和浓度,并且降低液化的温度和缩短糖化时间。基于上述工艺,对发酵阶段的一些参数进行了研究,初步确定了酵母的培养时间为24 h,发酵时间为48 h;单因素试验结果表明,营养物尿素的最适量为原料的0.5‰,磷酸二氢钾为0.5‰,氯化钙为1.0‰,硫酸镁为0.5‰。     

酵母菌PA4酿造苹果酒发酵条件的优化

通过三因素二次正交旋转回归实验设计，考察了发酵温度、接种量、发酵液初始pH值对酵母菌PA4酿造苹果酒品质的影响，得出苹果酒质量与影响因素的回归模型。结果表明：发酵温度和接种量对苹果酒质量的影响极显著(p＜0.01)，发酵液初始pH值对苹果酒质量的影响显著(p＜0.05)；菌株PA4酿造苹果酒的最佳工艺参数是发酵温度为24℃，接种量为10%，pH值为3.4。     

酵母培养物对断奶仔猪生长性能、机体抗氧化能力和免疫功能的影响

文章旨在研究酵母培养物在动物生产上的实际使用效果,试验选取断奶仔猪300头(21日龄断奶),随机分成3组,每组5个重复,每个重复20头仔猪,单栏饲养.分别饲喂基础日粮、基础日粮+1％的酵母培养物、基础日粮+100 mg/kg的金霉素,试验期为42 d.结果表明,在饲料中调价酵母培养物断奶仔猪的末重、平均日增重得到显著提...     

红曲米对蛋鸡生产性能的影响

选取30周龄海兰灰蛋鸡240只,随机分成4组,饲喂不同添加量的红曲米,研究其对生产性能的影响。结果表明,在蛋鸡日粮中添加1‰的红曲米,可以提高产蛋率、平均蛋重,降低料蛋比;随着红曲米添加量的增大,产蛋率、平均蛋重反而低于对照组,料蛋比高于对照组。说明在蛋鸡日粮中添加适量的红曲米,可以提高蛋鸡的生产性能。     

利用酵母双杂交系统筛选介体异沙叶蝉中与小麦矮缩病毒外壳蛋白互作的蛋白质

【目的】利用分离泛素酵母双杂交膜系统（split-ubiquitin yeast membrane system）,以小麦矮缩病毒（Wheat dwarf virus,WDV）的外壳蛋白（CP）基因为诱饵对异沙叶蝉（Psammotettix alienus L.）cDNA文库进行筛选,研究异沙叶蝉传播WDV的分子机制。【方法】以笔者实验室饲养的异沙叶蝉为材料,提取其总RNA后取100 ng进行纯化,利用SMART法反转录合成ds cDNA,经过Sfi I酶切纯化,连接到pPR3-N文库载体上,构建得到以pPR3-N为载体的异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库。同时,构建带有Sfi I酶切位点的诱饵载体pDHB1-WDV CP,经功能检测后用诱饵载体初步筛选pPR3-N空文库,寻找适合筛库的条件和确定His基因产物抑制剂3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）的使用浓度。然后用诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库,对筛选结果进行分析,再通过共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步验证是否发生互作。利用Uniprot和KEGG在线网站,对筛到的蛋白进行gene ontology（GO）注释和Pathway分析。【结果】初级文库库容量超过2.0×10⁶ cfu,文库实际扩增数量大于1.3×10⁶ cfu,文库重组率大于97%,扩增文库插入片段平均长度大于1 000 bp,表明异沙叶蝉cDNA文库的质量较高。酶切验证显示诱饵载体pDHB1-WDV-CP中CP的插入完整而准确。功能检测表明融合蛋白能够正确表达。在3-AT浓度为5 mmol?L^-1的筛选条件下,诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库得到280个克隆,经测序和Blast比对分析最终得到12个可能与WDV的CP发生互作的异沙叶蝉蛋白质。将这12个蛋白质再次进行共转验证和β-半乳糖苷酶检测,最终得到9个蛋白质与WDV CP互作。GO注释显示,9个蛋白参与的生物过程包括蛋白去磷酸化、碳水化合物代谢过程、先天性免疫应答、模式识别受体的信号通路、运输、同向运输和乙醇氧化等;分子功能包括金属离子结合活性、蛋白磷酸酶活性、信号模式识别受体的活性、水解酶活性、磷酸离子载体活性和叶酸运输活性等。参考KEGG数据库,这些蛋白参与的代谢途径有泛素介导的蛋白水解途径、内吞作用、花生四烯酸代谢途径、cAMP信号通路和模式识别受体的信号通路等。【结论】异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库的成功构建与筛选,为研究异沙叶蝉与小麦矮缩病毒的互作机制研究奠定了基础。     

稻瘟菌蛋白激发子在酵母双杂交系统中的自激活检测

利用PCR方法扩增稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1,并在其上下游分别引入酶切位点EcoRI和XhoI,经双酶切后与诱饵质粒载体pLexA连接构建重组诱饵质粒pLexA-PEMG1,将该重组诱饵质粒转入酵母菌株EGY48[p8op-lacZ]中进行β-半乳糖苷酶整板分析检测自激活。结果表明,成功构建了重组诱饵质粒pLexA-PEMG1,并且其无自激活报告基因作用,对酵母菌株也无毒性作用。这说明该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交系统,为筛选番茄cDNA文库获得诱饵蛋白PemG1的相互作用蛋白奠定了基础。