苏云金芽孢杆菌外孢囊蛋白基因敲除载体的构建

以苏云金芽孢杆菌(Bt)库斯塔克亚种(subsp.kurstaki) 8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt8010的外孢囊蛋白基因上下游序列,以含有卡那基因的pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建含外孢囊蛋白基因上游序列、卡那基因、外孢囊蛋白基因下游序列的基因敲除载体pRN5101UKD,为后续...     

一株对鳞翅目蔬菜害虫具有广谱高毒力的新Bt菌株

从河北省土壤分离出苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)MB-15菌株,利用室内生物活性测定的方法,与Bt标准菌株HD-1的杀虫毒力进行比较,结果发现该菌株胞晶混合液对棉铃虫(Helicoverpaarmigera)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、小菜蛾(Plutella xylostella)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)和菜青虫(Pieris rapae)等5种鳞翅目蔬菜害虫的毒力均高于标准菌株Bt HD-1胞晶混合液。对发酵液各组分活性的分析发现,该菌株的上清液对胞晶混合物的杀虫活性有明显的增效作用。光学显微镜下观察该菌株伴胞晶体为菱形,SDS-PAGE分析显示其伴胞晶体主要由130.0 kDa和65.0 kDa两种晶体蛋白组成。利用PCR-RFLP对其杀虫基因型进行鉴定,结果表明该菌株含有cry1Ac、cry2Aa、cry1I和vip3Aa基因。推断该菌株是一株对鳞翅目蔬菜害虫的防治具有潜在的商业开发价值的Bt野生株。     

超氧化物歧化酶与苏云金芽胞杆菌高温诱导产黑色素相关

为探讨苏云金芽胞杆菌高温诱导产黑色素机制,利用含mini-Tn10转座子载体pIC333构建苏云金芽胞杆菌油松亚种4CA1,随机插入突变体库,以寻找相关调控基因。通过高温诱导筛选得到1株在42℃产黑色素减弱的菌株;克隆得到mini-Tn10中断基因的部分序列,通过测序及同源性比对分析,确定中断基因为超氧化物歧化酶基因sodA2。     

苏云金杆菌CF1263菌株发酵条件优化的研究

对高毒BT菌株——CF1263进行液体振荡培养和正交试验结果表明:依据碳源、氮源和无机盐对芽孢产量的影响,对液体培养基进行成分优化组合,在碳源和氮源中分别筛选出最佳因子,淀粉、蛋白胨、牛肉膏、麦麸、酵母粉,从无机盐中筛选出KH2PO4和MgSO4.7H2O。运用以上7个因素进行L18(37)因素3水平的正交试验,从而得出CF1263最优配方为1.5%淀粉、2%蛋白胨、0.2%牛肉膏、0.3%麦麸、2.0%酵母粉、0.1%KH2PO4和0.2%Mg-SO4.7H2O。     

Cytolytic Toxin and Related Genes in Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis is a ubiquitous gram-positive, spore-forming bacterium that forms parasporal crystal during the stationary phase of its growth cycle. These crystal proteins, including Cry and Cyt protein, are toxic to certain insects. Lately, some problems about Cyt classification, structural characteristic, action mechanism and resistance to Cyt toxin are becoming new hotspots. We review the progress of above problems in several foreign labs.     

一株苏云金亚种的发酵产物对柳蚜3种保护酶活性的影响

为探究苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis Bt)对蚜虫的生物活性影响及作用方式,以苏云金亚种(Bacillus thuringiensis subsp.thuringiensis)为目的菌株,以发酵产物为材料。利用5种不同浓度的菌液分别喷雾处理柳蚜,72h校正死亡率为29.74%～78.88%,其浓度与及死亡率呈正相关关系。苏云金杆菌亚种发酵液和发酵液滤液处理柳蚜后,12～24h柳蚜超氧化物歧化酶(SOD)比活力均被抑制,其抑制率分别为21.06%～38.11%和4.69%～36.79%,其中18h、24h对SOD比活力的抑制达显著水平(p<0.05)。发酵液和滤液处理组18h前对柳蚜过氧化氢酶(CAT)比活力的影响总体呈激活趋势,其中发酵液和滤液处理组分别在18h、12h对柳蚜CAT的激活率最高,其CAT比活力分别为对照的1.8890倍和2.9463倍。滤液处理组对柳蚜POD比活力总体呈激活作用,其激活率为14.78%～57.39%;发酵液处理组6h和18hPOD比活力显著高于对照,其他时间点POD比活力与对照无显著差异。     

AcMNPV chiA基因表达产物对棉铃虫围食膜的破坏及对Bt和NPV的增效作用

采用PCR方法扩增出苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcMNPV)几丁质酶基因(chiA)编码区1.6kb全长片段,并将该片段分别克隆至原核表达载体pET30a和杆状病毒BactoBac表达系统转移载体pFastBac中,分别在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞系Sf-9中进行了表达。SDS-PAGE分析表明,在大肠杆菌和昆虫细胞中均有效表达了60kD的蛋白。将表达产物饲喂5龄棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫后取其围食膜,扫描电镜结果显示,围食膜结构遭到破坏形成大量孔洞。生物测定结果表明,以上两种表达产物对苏云金芽孢杆菌(Bt)和核型多角体病毒(NPV)均具有增效作用。以AcMNPVChiA在大肠杆菌和细胞系Sf-9中的表达产物分别与BtCry2Ac蛋白混合饲喂棉铃虫初孵幼虫,增效率分别为33.4%和54.5%,其LT50较对照处理分别缩短了17.8和20.6h;当AcMNPVChiA在大肠杆菌和细胞系Sf-9中的表达产物分别与甘蓝夜蛾(Mamestra brassica)核型多角体病毒(MbNPV)混合处理棉铃虫初孵幼虫时,其LT50与对照比较分别缩短了16.6和22.4h。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry7Ba1溶解性分子改良

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）杀虫晶体蛋白Cry7Ba1需要在强碱性缓冲液中（pH12.5）才能溶解,而且只有溶解后才能对小菜蛾（Plutella xvlostella）表现出毒力,其LC50为1.33μg/mL。分别用Cry1Ac和Cry1C晶体蛋白的C-半段替换Cry7Ba1的C-半段,结果发现当Cry7Ba1的C-半段被替换后,重组晶体蛋白与Cry1Ac和Cry1C等其它晶体蛋白一样在弱碱性条件下（pH9.5）能有效溶解,而且重组晶体蛋白对小菜蛾的杀虫活性没有发生明显变化,其LC50分别为1.32和1.39μg/mL。结果还显示重组晶体蛋白不需要经过体外溶解就能对小菜蛾表现出杀虫活性。研究结果揭示Cry7Ba1晶体蛋白难溶的特性是由其C-半段结构决定的,通过改变其C-半段结构改善溶解性,为该晶体蛋白在害虫生物防治中的应用提供了可能。     

苏云金杆菌(Bt8010)工业发酵过程研究

研究苏云金杆菌发酵过程诸多参数的变化对提高产品毒力很有意义。在５Ｌ发酵罐对Ｂｔ８０１０菌株进行培养,对发酵全过程的各参数包括葡萄糖消耗,细胞数和生物量增长,芽孢形成,溶氧和ｐＨ值变化等进行了详细的分析,用不同浓度葡萄糖进行培养,并对分批补料培养和分批培养结果进行比较,结果表明：葡萄糖浓度对发酵结果的影响很大。发酵过程的不同阶段,细胞的大小和结构各不相同,流加葡萄糖可以使发酵结果芽孢数达到１．２８×１０¹⁰个／ｍＬ。     

苏云金芽孢杆菌HD -1δ- 内毒素蛋白的纯化及其单克隆抗体细胞株的建立

从苏云金芽孢杆菌HD-1伴胞晶体中分离得到的毒素蛋白经过Sepharose 6B和DEAE Sephadex DE-52得到了纯化,纯化后的蛋白在SDS-PAGE上呈现一条带,其分子量约为68000。用纯化蛋白作为抗原免疫小鼠,通过杂交瘤技术建立了抗HD -1δ- 内毒素蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。经过半年的体外培养,大多数细胞株仍能持续分泌高滴度的单克隆抗体。文中还讨论了抗体的特异性及理化特性。此单克隆抗体细胞株的建立将为植物基因工程产物的检测提供有力工具。