杭州湾南岸滩涂贝类养殖环境中微生物数量分布及其类群

研究了杭州湾南岸慈溪滩涂贝类养殖区的微生物在水平、垂直及季节变化的分布规律。结果表明:3个采样区的异养细菌的数量变动在1.62×103~6.62×105cfu.g-1之间,平均值为4.28×104cfu.g-1,细菌数量在春季和夏季的数量偏低,10月份异养细菌的数量开始上升,并于11月份达到最高,表层高于底层;其中以革兰氏阳性菌比例最高,为主要的优势种,具有陆源性特点。各站位反硝化细菌、氨化细菌和硫酸还原菌的检出率均为100%,都维持在一个较高的水平,整体上数量具有表层高于底层的特点,3种微生物在数量上的季节演替与异养细菌具有类似的结果,均为10-11月达到最大。     

鲤细胞因子多克隆抗体的制备及检测

为从蛋白质水平研究细胞因子在鲤体内免疫应答过程中的合成变化,本研究采用PCR技术克隆TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β基因含有部分抗原决定簇的片段,引入双酶切位点Bam HⅠ和HindⅢ后连接至p ET-32a/21a,构建相应的表达载体,制备多克隆抗体。采用ELISA检测抗体效价,并以此作为实验工具,检测经嗜水气单胞菌感染后鲤血清中炎性细胞因子的合成变化。结果显示,基因TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β融合蛋白分子量分别约为31.8、31.7、35.3、32.5、18.0和33.6 ku;抗体效价达到2.4×106;在病原菌感染后的不同阶段,促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和抗炎细胞因子IL-10、TGF-β呈现出不同的合成变化。研究表明,制备的抗体具有较高的效价、亲和力和特异性,可用于鲤细胞因子的定量研究,该抗体的获得为鲤免疫应答与细胞因子合成的系统研究奠定了基础。同时,获取的鲤细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β的抗体亦可用于其他鱼类细胞因子蛋白质水平的定量研究。     

基于16SrDNA分析的浒苔外生细菌多样性研究

为研究浙江近海浒苔Ulva spp.(Enteromorpha spp.)外生细菌多样性,采用传统的形态学和16S rDNA测序分析的方法,从舟山朱家尖、宁海国华电厂和奉化南沙3个地区分离到可培养的浒苔外生细菌及其周围海水细菌65株。根据细菌菌落特征和革兰氏染色结果等将分离到的细菌分为26种表型。16S rDNA序列测序比对发现:菌株与不动杆菌属(Acinetobacter)、交替单胞菌属(Alteromonas)、弧菌属(Vibrio)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、赤细菌属(Erythrobacter)、微球菌属(Micrococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、深海杆菌属(Idiomarina)、Phaeobacter、Roseivirgaj和Silicibacter等23个属相应菌株具有较高同源性。对不同地区浒苔外生细菌进行了Shannon-Wiener多样性指数分析。研究表明:(1)宁海国华电厂的浒苔外生细菌多样性最丰富,多样性指数为93.98%;(2)浒苔外生细菌与其生活地区密切相关,其群落组成具有地域差异,其优势类群也不尽相同,但均归属于变形菌门。     

多糖和益生菌对暗纹东方纯免疫功能的调节

2003年春以来，山东、辽宁等地区养殖的仿刺参出现急性口围肿胀症，其症状是口围肿胀，体表溃烂，排脏，管足附着力下降，脱落沉至池底，死亡率较高。从病参口围、体表及体壁分离出优势菌10株，经人工感染试验证实其中菌株KW21、KW22、KW23、NB13和NB14是引起仿刺参出现急性口围肿胀症的病原菌。通过16S rRNA基因序列同源性及系统发育分析表明，菌株KW21为Mahnomonas dokdonens／s；菌株KW22和菌株NB13具有相近的亲缘关系，两者均与Vibrio splendidus有较高的相似性（99％，98％）；菌株KW23为Vibrio tapetis；菌株NB14为Vibrio sp．。5株病原菌均为革兰氏阴性菌，电镜下观察菌株KW21棒杆状；菌株KW22、KW23、NB13和NB14分别为杆状、弧状、卵圆形和卵圆形，且都具有单极生鞭毛。药物敏感性试验结果表明，诺氟沙星、氧氟沙星和红霉素对5株菌均有较强的抑菌作用。Vibrio tapetis，Vibrio splendidus和Marinomonas dokdonensi作为仿刺参的病原菌属首次报道。     

青岛陆源排污口邻近海域异养细菌的组成与分布

对青岛近海度假区、港口区、养殖区、工业区4类排污口邻近海域异养细菌的组成与分布进行了调查研究,采用海洋异养细菌平板涂布培养法分离细菌,基于16S rDNA的扩增性DNA限制性酶切片段分析(ARDRA)进行聚类筛选并测序鉴定。结果显示,青岛排污口邻近海域可异养培养的菌株分布于变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)4个细菌类群,变形菌门细菌数量占总测序数量的68%,其中γ-变形菌纲的数量在变形菌门中占88%;不同海域中细菌组成与分布有所不同,放线菌门和拟杆菌门的细菌种类较少且各海域分布有所不同,但γ-变形菌纲的弧菌属细菌(Vibrio sp.)在4类海域中均被发现,占总检测量的18.54%,其中溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)占弧菌总量的25%。不同海域也检测到V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.campbellii、V.parahaemolyticus等水产养殖业的潜在致病菌。根据16S rDNA系统进化关系和细菌门类聚类分析得到的结论推断,工业区与养殖区海域的细菌组成和分布相似度较高,推断各海域的细菌组成与排污口类型有一定相关性。     

Effects of different dietary copper sources on the growth and intestinal microbial communities of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei)

An 8‐week feeding trial was conducted to evaluate the effects of dietary copper sources on growth performance and intestinal microbial communities of juvenile Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei). Four isonitrogenous (420 g/kg crude protein) and isolipidic (70 g/kg crude lipid) experimental diets were formulated to contain different copper sources, Diet NSC (no‐supplemented copper), Diet CS (copper sulphate), Diet Availa (copper amino acid complex from Availa^®Cu100) and Diet M (1:1, copper sulphate + copper amino acid complex). A total of 360 Pacific white shrimp juveniles (initial weight: 1.86 ± 0.03 g) were randomly allocated into four groups, with three replicates per group and 30 shrimps each replicate. An Illumina‐based sequencing method was used to analyse the intestinal bacterial composition of shrimp juveniles. The results revealed that shrimps fed Diet M had significantly higher percent weight gain (PWG) than that fed Diet NSC and Diet CS, while there were no significant differences between Diet M and Diet Availa. Survival was not affected by the dietary copper sources. Proteobacteria and Bacteroidetes were dominant in the intestines of Pacific white shrimp. Shrimps fed Diet M and Diet Availa had higher bacterial richness and diversity than those fed Diet NSC and Diet CS with no significant differences among all treatments. Furthermore, Diet M and Diet Availa which contained copper amino acid complex reduced the relative abundance of Vibrionaceae in shrimp intestinal tract. This study indicated that dietary copper sources could affect the intestinal microbial communities and diets supplemented with Availa^®Cu100 could have a positive impact on the growth performance and decrease the potential risk of disease in Pacific white shrimp.     

头孢氨苄对斑节对虾幼体发育及育苗水体细菌数量的影响

研究了不同浓度头孢氨苄(Cefalexin)对斑节对虾Penaeusmonodon幼体发育以及对斑节对虾育苗水体中异养菌总数和弧菌数量的影响。在试验初期,无论是对照组还是施用头孢氨苄的各试验组,育苗水体中的总异养菌数量和弧菌数量都呈现出较为明显的上升趋势;在第二次施用头孢氨苄后,各试验组的异养菌总数和弧菌数量的增幅明显低于对照组(或出现异养菌总数和弧菌数量缓慢下降),而对照组异养菌总数和弧菌数量则呈现显著的上升。施用0.5～1.0μL·L-1头孢氨苄对育苗水体中的总异养菌有显著的杀灭及抑制作用,但对弧菌数量杀灭及抑制作用并不显著;施用1.5μL·L-1头孢氨苄对育苗水体中的总异养菌和弧菌数量的杀灭及抑制作用显著。当幼体变态发育至仔虾第8天(P8)时,对照组异养菌总数和弧菌数量分别达6.33×105和3.55×104CFU·mL-1,均远远高于试验组的异养菌总数和弧菌数量增长的幅度。试验组的幼体变态到P1期的时间,比对照组缩短了10h以上;试验组的成苗率也比对照组提高了3.2%～13.1%。     

光合细菌FP04的筛选及对中华鳖养殖水质和生产效益的影响

从入海排污口污泥中筛选到一株有较强净化养殖水质能力的光合细菌,初步鉴定其为红螺菌,命名为FP04。实验室试验表明,FP04能有效降低养殖污水的CODcr含量。在中华鳖的养殖水体中加入不同浓度的FP04,结果与对照组比较,FP04可显著降低养殖水体中的氨氮和化学需氧量,并可减少甲鱼病害发生,提高甲鱼养殖成活率和增重率,其中以养殖水体中FP04浓度为9×104CFU/mL的效果最好,成活率和增重率分别提高14%和31%。     

尼罗罗非鱼鼠李糖凝集素 (RBL-1)在非特异性细胞防御病原菌感染中的功能

为了探究鼠李糖凝集素（Rhamnose-binding lectin, RBL）在硬骨鱼非特异性细胞防御病原菌感染中的作用,本研究以尼罗罗非鱼为研究模型,首先通过分离头肾单核/巨噬细胞进行体外菌应激实验,发现在罗非鱼两种重要的致病菌-无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）应激后,尼罗罗非鱼L-鼠李糖凝集素1（OnRBL-1）的表达量显著上调。然后,通过荧光定量PCR（qRT-PCR）检测发现OnRBL-1重组蛋白能够调节病原菌诱导细胞炎症因子的表达,包括显著抑制菌诱导的IL-6、IL-8和TNF-α的表达,和促进IL-10和TGF-β的表达。此外,通过流式细胞术检测证实OnRBL-1具有促进单核/巨噬细胞的吞噬作用,同时增强呼吸爆发水平和上调活性氧的释放。以上研究结果表明,OnRBL-1在罗非鱼单核/巨噬细胞非特异性细胞防御中发挥重要的调节作用。本研究为探讨RBL-1在硬骨鱼宿主防御病原菌感染中的功能提供了参考,并有助于完善和丰富硬骨鱼类RBL的功能和在抗菌免疫应答中的基础理论体系,具有重要的科学意义。     

尼罗罗非鱼铁调素调节蛋白在宿主抵御病原菌侵染和调节铁稳态中的功能

为了研究铁调素调节蛋白(hemojuvelin,HJV)在硬骨鱼中抵御病原菌感染和维持自身铁稳态过程中的作用,实验扩增了尼罗罗非鱼铁调素调节蛋白基因(Onhjv)的开放阅读框(ORF),分析其在健康尼罗罗非鱼各组织中的分布模式及在抵御病原菌感染和调节铁稳态中的相关作用。结果显示,Onhjv的ORF全长由1 248个碱基组成,编码415个氨基酸,在不同物种之间具有一定的保守性。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,Onhjv在尼罗罗非鱼各组织中广泛分布,并在肝脏中的表达量最高。在无乳链球菌或嗜水气单胞菌感染后,Onhjv在肝脏、脾脏、肠和鳃中的表达量均显著上调。体外头肾单核/巨噬细胞和肝细胞中Onhjv表达量在受到这2种病原菌应激下也显著上调。此外,在1和10μmol/L FeCl_3溶液刺激后,Onhjv表达量在肝脏、脾脏、肠和鳃等组织,以及头肾单核/巨噬细胞和肝细胞中的表达量也呈显著上调。受重组罗非鱼IL-6蛋白[(r)OnIL-6]刺激后,头肾单核/巨噬细胞中Onhjv表达量显著上调,表明炎症因子可以促进Onhjv表达。研究表明,尼罗罗非鱼铁调素调节蛋白在宿主抵御病原菌感染和维持铁稳态的过程中发挥作用。本实验为探究HJV在硬骨鱼中的生物学功能提供了参考,同时为进一步研究铁代谢在宿主防御病原菌感染过程中的重要作用提供理论指导。