库尔勒香梨的苹果褪绿叶斑病毒cDNA探针检测技术研究

以库尔勒香梨叶片和皮层为材料,对两种植物总RNA提取方法进行了比较研究,从中筛选出了适合库尔勒香梨的提取方法;并利用RT-PCR反应体系成功合成了生物素标记的cDNA探针,在此基础上,对影响杂交灵敏度的主要因素进行了实验研究。结果表明,当探针浓度为400ng/mL,甲酰胺浓度为45%,42℃杂交反应6h,可获得最高灵敏度。Tween20的封闭效果比牛血清白蛋白好。对不同组织和不同提取方法提取的总RNA进行了杂交检测,并对库尔勒地区香梨带毒情况进行了检测。结果表明,不论幼叶、老叶、皮层及冷冻叶片均可出现杂交信号,两种提取方法提取的总RNA也都出现了杂交信号,库尔勒香梨样品有45%的带苹果褪绿叶斑病毒。     

大丽轮枝菌毒素诱导表达陆地棉cDNA序列的克隆与定位

 为获得陆地棉黄萎病抗性相关候选基因，利用棉花黄萎病菌大丽轮枝菌V991毒素粗提物诱导耐黄萎病陆地棉品种'中棉12'应激基因的表达。在诱导幼根24 h时间点提取总RNA，PCR法合成双链cDNA，应用抑制消减杂交技术[1]，得到了差异表达的180个克隆。经反Northern blot筛选出15个受毒素粗提物诱导应激表达的阳性cDNA克隆，将其命名为Vdrg（response gene induced by toxin of Verticillium dahliae）。本研究对所得阳性cDNA克隆进行了序列分析，并利用Pima S6 与 Acala Maxxa 海陆杂交四倍体棉花F2群体对Vdrg序列进行了棉花基因组定位。     

荔枝果实两个膨大素基因的克隆与序列分析

 以荔枝品种妃子笑果实的cDNA为模板 ,设计膨大素的简并引物 ,进行RT PCR。得到的扩增产物经纯化后与pGEM T Easy载体连接 ,转化大肠杆菌。任意挑选阳性克隆 ,进行序列分析 ,得到 2个序列不同的膨大素基因片段 ,分别命名为Lc Exp1和Lc Exp2。这 2个基因片段中均存在膨大素基因的保守区域 ,即 8个半胱氨酸残基和 3个色氨酸残基。Lc Exp1和Lc Exp2分别编码 177和 179个氨基酸 ,2者间的碱基同源性为 71.6% ,氨基酸同源性为76.3 %。在氨基酸水平上 ,Lc Exp1与Fa Exp2、Pp Exp1的同源性分别为 92 .7%和 92 .1% ,而Lc Exp2与Fa Exp2、Pp Exp1的同源性仅为 77.4%和 76.3 %。     

牦牛角真皮乳头cDNA文库的构建

构建cDNA表达文库用于克隆和研究牦牛角生长相关基因.Trizol提取牦牛角真皮乳头总RNA并纯化mRNA,用ZAP Express cDNA Synthesis Kit合成双链DNA,进行末端修饰,接入ZAP表达载体.经Gigapack Ⅲ Gold Packaging extract体外包装,转染XL1-Blue MRF'宿主菌,形成初级文库,初级文库进一步扩增形成稳定的cDNA文库.结果表明,文库库容量为4×107,重组率达93%,为进一步从文库中筛选相关基因提供了有效工具.     

乌鸡卵清白蛋白基因cDNA的克隆及同源性分析

乌骨鸡是原产中国的观赏和药用珍禽 ,在中国的饲养历史悠久。金水乌鸡是湖北省农业科学院以江西泰和鸡为主 ,按照白羽丝毛乌骨鸡的十大特征 ,进行闭锁性继代选育获得的一个特有品种。卵清白蛋白是鸡蛋中蛋白质的主要成分 (占总蛋白的 5 4 % ) [1 ] ,其合成与分泌严格地受激素包括雌激素和孕酮的调节[2 ] 。目前 ,鸡卵清白蛋白的基因结构及功能已较为清楚 ,为 7个外显子的分离基因[3] ,转录后经内含子的切除 ,连接成为成熟的ｍＲＮＡ。由于卵清白蛋白基因只在输卵管细胞中表达 ,因此 ,该基因在输卵管蛋白质合成与分泌中具有主要的调控作用。…     

小麦种子萌发期水分胁迫诱导表达差异cDNA的研究

以小麦幼芽为材料,采用mRNA差异显示方法和银染技术,对经过用16%(-0.5 MPa)PEG-6000溶液处理不同时间而诱导表达的小麦基因进行分离,共得到cDNA差异片段16条。其中4条差异条带呈表达减弱,其余差异条带均呈表达增强。测序结果与GenBank数据库比对,2个cDNA片段与已知基因同源,WSI241与编码胚后期丰富蛋白的Em基因同源性达100%,WSI208与ARA-1 mRNA同源性达88%。大部分都是功能未知的EST序列。其中WSI483(454 bp)与小麦干旱胁迫幼苗cDNA同源性达100%;WSI232与小麦干旱胁迫叶cDNA同源性达100%。WSI301与小麦盐胁迫芽鞘cDNA同源性达98%,WSI267与小麦热胁迫旗叶cDNA同源性达93%,WSI289与小麦ABA处理胚cDNA同源性达92%,WSI268与镰刀菌感染的小麦穗同源cDNA同源性达97%。经反向Northern验证,有6个cDNA呈阳性。可用探针或设计引物作进一步研究。     

牛FABGL基因cDNA的克隆与序列分析

以中国西门塔尔牛肝脏组织为材料,运用同源序列克隆技术结合RT-PCR和RACE技术,对牛FABGL基因的cDNA进行了克隆与序列分析,并对推导的FABGL蛋白结构与性质进行了初步分析。结果表明,牛FABGL基因的cDNA序列长994 bp,包括780 bp的开放阅读框、16 bp的5′非翻译区和198 bp的完整3′非翻译区,由260个氨基酸组成。该基因cDNA核苷酸编码区序列与猕猴、人、猪和小鼠FABGL基因的相似性分别为89%,89%,87%和86%。推导的氨基酸序列与猕猴、人、猪和小鼠的相似性分别为89%,87%,89%和86%。以FABGL基因cDNA编码区序列构建的分子进化树研究结果表明,牛的FABGL基因在人、猕猴、猪、鼠等物种中,与猪的亲缘关系最近。牛的FABGL蛋白的三级结构包含2个跨膜结构—Cu toff模体,分别位于11~16位氨基酸和128~131位氨基酸处。     

鸡IL-2基因cDNA输卵管组织特异性表达载体的构建与表达

将克隆并测序的鸡卵清蛋白基因5′端调控序列和鸡IL-2基因cDNA,以串联方式置于真核表达载体pcDNA3的CM V启动子下游,构建了鸡输卵管定位表达载体pcDNA3-OVP-IL 2。将真核表达载体pcDNA3-IL 2和构建的输卵管定位表达载体pcDNA3-OVP-IL 2分别转染鸡输卵管上皮细胞,激素诱导72 h后,用淋巴细胞转化试验检测细胞培养液中IL-2的表达水平及生物学活性。结果显示,转染细胞均可表达IL-2,且所表达的IL-2有促进T淋巴细胞转化和淋巴母细胞成熟的活性;转染pcDNA3-OVP-IL 2的输卵管上皮细胞表达产物在1∶256稀释水平下仍具有促进T淋巴细胞转化和淋巴母细胞成熟的活性。转染pcDNA3-IL 2载体的输卵管上皮细胞虽有IL-2表达,但水平较低。     

猪肝脏组织表达序列标签(ESTs)的初步分析

 构建了猪肝脏组织cDNA文库 ,并对文库中随机挑选的 4 38个克隆的表达序列标签 (ESTs)进行了研究。结果表明 ,在所研究的 4 38个ESTs中 ,186个在猪种中已有匹配序列 ,37个在人类及其它物种中可以找到同源序列 ,2 15个为未知功能基因。试验还测定了文库中 4 5个cDNA克隆的全长插入序列 ,结果表明 ,19个为已知功能基因 ,11个没有发现开放阅读框 ,其它 15个具有开放阅读框 ,但基因的功能未知。这些结果初步代表了肝脏组织的功能基因表达谱。