检测猪戊型肝炎病毒的荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中猪戊型肝炎病毒的ORF2核苷酸序列的保守区域设计合成一对特异性引物,建立了一套SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR检测猪源戊型肝炎病毒(swHEV)的方法,并评价了该方法的灵敏度、稳定性和特异性,同时与常规的RT-nPCR进行对比分析.结果表明,建立标准曲线的相关系数为0.998,斜率为-3.039,Ct值变异系数(CV)在0.17％～1.41％之间,有良好的稳定性.同时在检测猪群常见病中显示出很好的特异性,并且比RT-nPCR更灵敏,适合于swHEV的检测.     

Demonstrating freedom from disease using multiple complex data sources 2: case study--classical swine fever in Denmark

A method for quantitative evaluation of surveillance for disease freedom has been presented in the accompanying paper (Martin et al., 2007). This paper presents an application of the methods, using as an example surveillance for classical swine fever (CSF) in Denmark in 2005. A scenario tree model is presented for the abattoir-based serology component of the Danish CSF surveillance system, in which blood samples are collected in an ad hoc abattoir sampling process, from adult pigs originating in breeding herds in Denmark. The model incorporates effects of targeting (differential risk of seropositivity) associated with age and location (county), and disease clustering within herds. A surveillance time period of one month was used in the analysis. Records for the year 2005 were analysed, representing 25,332 samples from 3528 herds; all were negative for CSF-specific antibodies. Design prevalences of 0.1-1% of herds and 5% of animals within an infected herd were used. The estimated mean surveillance system component (SSC) sensitivities (probability that the SSC would give a positive outcome given the animals processed and that the country is infected at the design prevalences) per month were 0.18, 0.63 and 0.86, for among-herd design prevalences of 0.001, 0.005 and 0.01. The probabilities that the population was free from CSF at each of these design prevalences, after a year of accumulated negative surveillance data, were 0.91, 1.00 and 1.00. Targeting adults and herds from South Jutland was estimated to give approximately 1.9, 1.6 and 1.4 times the surveillance sensitivity of a proportionally representative sampling program for these three among-herd design prevalences.     

利用工厂化养猪理论参数动态监测猪群生产

猪群生产是猪场日常工作的核心，一个猪场的效益主要由猪群生产的水平高低而直接体现。而猪群生产中的基础母猪数量、每周配种母猪数、怀孕率、分娩率、窝均产仔数、仔猪存活率、育仔存活率、育成存活率、母猪淘汰率和母猪分娩指数等工厂化养猪参数又是直接衡量猪群生产的水平高低的一系列硬指标，因此，利用工厂化养猪参数可以监测某个时间段的猪群生产的状态。原理是依据现有猪场的基础母猪数量和猪群的某个时间段初期的实际繁殖状态，通过计算机根据工厂化养猪理论参数模拟运算产生出标准猪群生产数据，将之与猪场猪群生产的实际数据相比较，并制出曲线对比图，从对比图中可直观看出猪群生产中的各个环节的优劣，这样就实现了对猪群生产的某个时间段的动态监测功能。     

鸡致病性大肠杆菌1型菌毛fimI基因克隆与序列测定

对鸡O2血清型致病性大肠杆菌1型菌毛fimI基因进行了扩增并与国外同源菌株基因序列进行了比较。结果表明：两者核苷酸同源性达98．42％，预测氨基酸顺序同源性达98．92％。fimI基因的预测氨基酸序列中仅第46位氨基酸由ALA变为THR，第76位氨基酸由SER变为ALA，其余核苷酸的变化未影响氨基酸的翻译，推测，这种改变是由分离株的差异所引起的。     

自身启动子控制的卡那霉素抗性基因在哺乳动物细胞中表达的检测

为了研究卡那霉素抗性(KanR)基因能否在哺乳动物细胞中表达以及用含相同抗性基因重组质粒防治奶牛乳腺炎的安全性,用PCR从重组质粒p215C3LYZ中扩增得KanR基因,将其克隆入原核表达载体pQE-31,用含卡那霉素(Kan)琼脂平板筛选得KanR重组菌,经IPTG诱导成功表达了预期大小的Kan抗性融合蛋白;用纯化的重组蛋白免疫小鼠,获得了Kan抗性蛋白抗血清,经Western blotting证明免疫血清特异性良好;分别用重组质粒pQE-Kan和p215C3LYZ转染COS-1细胞,在不含抗生素培养液中培养后分别收集细胞上清和细胞裂解物;将转染细胞上清分为添加和不加Kan组,接种Kan敏感菌DH5α大肠杆菌,培养物的OD600检测结果显示,添加组的指示菌生长被抑制,转染细胞上清中无Kan抗性蛋白表达;以Kan抗性蛋白免疫血清进行的Western blotting结果显示,转染细胞内无Kan抗性蛋白表达;将p215C3LYZ注射奶牛乳腺,用脱脂和浓缩奶样进行Western blotting检测,结果显示试验牛乳中也无Kan抗性蛋白表达。这些试验结果提示,来源于原核大肠杆菌的KanR基因启动子在动物细胞中无转录活性,乳腺注射含KanR基因的重组质粒不会表达对奶牛和人体有害的Kan抗性蛋白。     

雏番鸭鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌混合感染诊疗

吉林市船营区某鸭场雏番鸭发病死亡,经流行病学调查、临床症状、病理剖检、实验室诊断,最终确认为大肠杆菌与鸭疫里默氏杆菌混合感染。经过综合治疗,疫情得到控制。     

电针对大肠杆菌热敏肠毒素致肠水、钠分泌的拮抗作用

新生仔猪下痢是严重危害养猪业的常见病、多发病,而肠致病性大肠杆菌产生的肠毒素特别是热敏肠毒素(Heat-Labileenterotoxin,LT)则是导致幼畜腹泻的直接致病因子。在兽医临床上,由于广泛使用抗菌药物治疗仔猪下痢,大肠杆菌对这些药物普遍地产生了耐药性,致使临床疗效越来越差。针灸疗法是我国传统医学的宝贵遗产,已有不少文献报道了针灸对哺乳仔猪下痢良好的防治效果,但有关针灸防治仔猪下痢机理的研究则相对滞后。为此,本试验应用兔回肠结扎实验动物模型观察了电针刺激对大肠杆菌热敏肠毒素致肠水、钠分泌的拮抗作用,以便为针灸防治…     

利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联技术构建产肠毒素大肠杆菌LT敲除菌株

本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联的技术对产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）K88的热不稳定性肠毒素（heat-labile toxin,LT）基因进行无痕敲除并获得K88 LT^-缺陷菌株。通过序列比对获取LT两端同源序列,并构建包含LT边界、氯霉素筛选标记、sgRNA和LT同源臂的供体片段;将供体片段转化至ETEC K88,同时分别利用λ-Red同源重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统,对LT基因进行敲除;通过PCR验证获得了K88 LT^-缺陷菌株,并通过试验测定了敲除菌株的溶血能力和生长曲线。结果显示,λ-Red同源重组系统可成功地将LT基因替换为相应的供体片段,CRISPR/Cas9基因编辑系统可高效地对筛选标记进行删除,最终通过λ-Red和CRISPR/Cas9结合的基因编辑系统可成功对ETEC K88的LT基因进行无痕敲除。体外试验结果表明,K88 LT^-缺陷菌株的溶血能力丧失,并且生长速度比野生型菌株减缓,LT可能和ETEC K88的致病能力和生长性能有关。表明λ-Red和CRISPR/Cas9级联的基因敲除方法可用于LT毒素基因及其他一些大肠杆菌基因的敲除。K88 LT^-缺陷菌株的构建为下一步研究LT毒素的致病机制奠定基础。     

抗菌肽天蚕素B突变体ABP-S1基因在E.coli中的融合表达

利用绿色荧光蛋白 (GFP)基因与天蚕素 B突变体 ABP- S1基因的融合基因 ,构建了 2个原核表达载体 p Am GS1和 p Bm GS1,转化表达宿主菌 E.coli BL 2 1(DE3)和 E.coli BL 2 1(DE3) p L ys S。结果 ,p Am GS1未能得到转化子 ,而p Bm GS1的转化子高效表达了融合蛋白 ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检查 ,融合表达产物最高可占菌体总蛋白的49.45 %。表达产物经包涵体复性 ,柱层析初步纯化 ,通过平板抑菌试验 ,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌以及鱼类重要的致病菌嗜水气单胞菌等多种革兰氏阳性、阴性菌表现出较强的抗菌活性     

猪组织中硫酸头孢喹肟含量测定和肌注给药残留研究

建立了硫酸头孢喹肟在仔猪组织内残留的高效液相色谱分析法.色谱条件:采用C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm),称取一水合高氯酸钠3.45 g溶于1 000 mL水中,加磷酸12 mL,用三乙胺调至pH3.6,将此溶液与乙腈按90∶10的比例混合作为流动相,紫外检测波长为270 nm.将头孢喹肟以20、100、500μg/kg分别添加到空白组织中,测得肌肉、肝脏、肾脏、肺脏、脂肪+皮肤组织中头孢喹肟回收率均在78%以上,平均回收率分别为81.57%、82.42%8、1.29%8、3.97%、78.80%.日内变异RSD在1.82%~6.25%之间,日间变异RSD在1.11%~6.35%之间.该方法的最低检测限为20μg/kg,在20~500μg/kg范围内时,线性关系良好.以2 mg/kg的剂量肌肉注射2.5%头孢喹肟注射液,连续用药5 d,于最后1次给药后测定不同组织中头孢喹肟的浓度.结果表明,停药后各组织中头孢喹肟浓度逐渐下降;最后一次注射后的第4 d,肺脏、脂肪+皮肤中已经检测不到头孢喹肟;最后一次注射后的第5天,所有组织均检测不到头孢喹肟.建议休药期为3 d.