绵羊瘤胃上皮细胞的体外分离培养、冻存及复苏方法

本研究旨在建立绵羊瘤胃上皮细胞(Ovine rumen epithelial cells,ORECs)的分离培养、冻存和复苏方法,为反刍动物瘤胃功能的研究和相关瘤胃疾病的发病机制研究提供功能性的细胞模型。以绵羊瘤胃为研究对象,采用胰蛋白酶连续消化法对瘤胃组织进行不同时间(40、30、20、10、10、8和5 min)的消化,并对每次消化后的瘤胃组织和消化液分别进行H.E染色分析和显微镜观察,以确定细胞开始收集及终止消化的时间,最后将收集的瘤胃上皮细胞进行原代培养。在传代培养时,运用差时消化法和差速贴壁法对ORECs进行纯化,并从细胞形态学、细胞生长曲线、角蛋白18(CK-18)免疫荧光染色和上皮细胞标志物E-钙黏蛋白和碱性磷酸酶基因表达等方面对ORECs进行鉴定。然后设置不同体积配方的冻存液,将传代细胞进行冻存,通过检测复苏后的细胞活力和24 h贴壁率确定最佳冻存液配方。结果表明:第4次消化后就基本消化到瘤胃组织的棘层,此时即可开始收集细胞;第7次消化完后瘤胃上皮的基底层细胞基本被消化掉,此时即可终止消化细胞。经纯化后传代的细胞呈现均一的"铺路石"形态,生长曲线明显呈"S"形,且经CK-18免疫荧光染色后鉴定为阳性,同时PCR检测到上皮细胞特异性标志蛋白E-钙黏蛋白和碱性磷酸酶均有表达。此外,ORECs经不同体积配方冻存液冻存复苏后发现,冻存液配方为V_(FBS)∶V_(DMEM)∶V_(DMSO)=9∶0∶1时ORECs的细胞活力及贴壁率最高,且传代后的细胞生长状况良好。因此本试验成功建立了ORECs的体外分离培养、冻存和复苏方法。     

猪核移植供体细胞的分离培养及传代的研究

通过对猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代的研究,摸索出一套猪体细胞的分离、培养和传代的方法,建立了猪的供体细胞系。研究结果表明:猪的卵丘细胞单层的生长需要5~6 d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞,组织块法单层的生长需要10~11 d,酶消化法需要8~9 d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系,这些供体细胞培养方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞材料来源。     

西伯利亚花楸试管苗保存技术

以西伯利亚花楸幼嫩茎段为外植体,0.1%(m/v)升汞消毒6 m in,在MS+6BA 0.8 mg/L+NAA 0.08 mg/L+KT 0.4 mg/L+IBA 0.04 mg/L的增殖培养基上,成功地建立了西伯利亚花楸试管苗增殖体系。研究了不同保存条件和培养基对试管苗保存效果的影响,结果表明:试管苗在(2±2)℃的冰箱冷藏室,可有效保存240天以上,在MS+琼脂7 g/L+蔗糖50 g/L的培养基上,试管苗的生长得到明显的抑制。保存后的试管苗增殖、生根、驯化效果良好,生长正常。     

TDZ和GA3对提高红叶石楠组培快繁效率的研究

研究苯基噻二唑(TDZ)和赤霉素(GA3)对红叶石楠组培快繁效率的影响,结果表明:红叶石楠两品种继代培养能适应多种基本培养基,在MS、4/5 MS和B53种基本培养基中,红叶石楠的继代增殖率均达到3.0以上;在继代培养中,TDZ、GA3的添加对继代周期、年增殖率均有显著影响,但对增殖倍率没有显著影响;在生根培养基中添加GA3有效地缩短生根诱导时间及生根培养时间,提高红叶石楠的组培快繁效率,降低组培苗的生产成本。     

三尖杉愈伤组织诱导及其分化的初步研究

以三尖杉茎尖、嫩叶为外植体,应用正交设计法对愈伤组织诱导及其继代分化进行了研究。结果表明,不同外植体灭菌的难易程度相差较大,叶片较茎尖容易;叶片用体积分数为75%的酒精浸泡30-45 s,经体积分数为0.1%HgCl2溶液灭菌12 min,效果最好;茎尖则用体积分数为75%酒精浸泡1 min,经体积分数为0.1%HgCl2溶液灭菌12 min,效果较好;诱导叶片、茎尖愈伤组织的最佳培养基配方为MS+NAA 1.0 mg.L-1+2,4-D 1.0 mg.L-1;愈伤组织在继代培养基上均能进行分化,其中结构紧密的茎尖愈伤组织在MS+6-BA3.0 mg.L-1培养基上继代培养能诱导分化形成不定芽。     

木兰科7种植物的组织培养技术研究

金叶含笑、长蕊含笑、阔瓣含笑、峨眉含笑、乐东拟单性木兰的茎尖、茎段腋芽在诱导分化培养基MS 6BA(0.5~2)mg/L NAA(0.1~0.2)mg/L中培养能直接从幼芽基部分化出不定芽。不定芽继代培养增殖新生芽平均数分别为3.0,3.5,2.8,3.8,2.5棵;杂种鹅掌楸和鹅掌楸的幼芽在诱导分化培养基中培养,脱分化后产生不定芽,不定芽继代培养增殖新生芽平均数5棵,但幼芽体较小,茎杆短,茎尖生长慢。诱导分化外植体的最适温度在20~23℃,过高过低都不利于产生不定芽。当幼苗生长至1.0~2.5 cm高时即可作生根诱导。     

南方红豆杉愈伤组织诱导和继代培养体系的建立

以南方红豆杉为材料,建立了其愈伤组织诱导与保持的技术体系,主要为:(1)南方红豆杉侧芽是诱导愈伤组织的最佳外植体;(2)南方红豆杉愈伤组织诱导的最佳培养基为:B5+2.0 mg.L-12,4-D+1.0 mg.L-1NAA+0.2 mg.L-1IAA;(3)南方红豆杉愈伤组织增殖的培养基为:B5+4.0 mg.L-1NAA+0.5 mg.L-12,4-D+0.2 mg.L-1GA+500 mg.L-1AC+2000 mg.L-1LH.并在培养基中同时添加AC、LH和GA33种抗褐物质,取得较好的抗褐化效果.     

草地早熟禾耐盐愈伤组织筛选的适宜NaCl浓度和继代次数研究

草地早熟禾(Poa pratensis L.)是禾本科早熟禾属多年生草本植物,是我国北方地区应用最广泛的冷季型草坪草.近年来,由于土壤的盐化问题日益严重,培育耐盐的草地早熟禾品种显得尤为重要.体细胞无性系变异是来源于已经存在的细胞变异和培养过程中诱导的变异[1].变异的诱导与选择为提高植物的耐盐性提供了一条有效的途径.     

保存8~33年的苹果试管苗增殖能力与端粒长度分析

为分析苹果试管种质端粒长度与繁殖能力、衰老的关系,探索端粒长度与苹果试管种质离体保存年限的关系,对保存多年的不同继代次数的3个苹果品种试管苗进行了表型、增殖能力以及端粒长度的研究。结果表明:保存了8~33年的‘富士’、保存8~27年的‘金冠’和保存8~25年的‘嘎拉’苹果茎尖试管苗继代增殖能力大部分没有变化,表型未发生明显变化;3个品种不同继代次数30 d苗龄试管苗叶片端粒长度均差异不显著;继代73代苗龄分别为10、30、50和90 d的试管苗叶片端粒长度变化因品种而异,‘富士’‘嘎拉’差异不显著,‘金冠’50 d苗龄的最长,90 d苗龄的最短;继代71代苗龄30 d的‘金冠’试管苗茎段端粒长度显著高于叶片,茎段和愈伤组织、叶片和愈伤组织之间差异不显著,‘嘎拉’表现为愈伤组织>叶片>茎段。苹果试管苗端粒长度变化与其增殖能力、表型及同一继代周期内衰老程度的变化相吻合。     

满天星茎尖试管苗的继代培养基研究

探讨了满天星试管苗继代培养过程中,不同生长调节剂、碳源、水质、活性碳对芽增殖效果的影响.结果表明,NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L的生长调节剂组合下,试管苗增殖效果最好,芽的长势好,增殖倍数达5.0;用40 g/L的市售白糖代替30 g/L的化学纯蔗糖作为培养基的碳源,既可降低配制培养基的成本,又不影响苗的增殖和质量,可用于满天星试管苗的商业化生产;但以自来水代替蒸馏水对试管苗进行继代培养,则不利于苗的生长和增殖;在培养基中加入0.2%的活性碳有利于试管苗株高的增加,但不利于芽的增殖.