不同培养基继代培养球孢白僵菌对西花蓟马毒力和产孢量的影响

【目的】通过开展连续继代培养对高毒菌株产孢和毒力的影响研究,获得对西花蓟马(Frankliniella occidentalis)毒力和产孢量均高且稳定的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株,进一步提出有效防止菌株退化、优良菌株保存和改良的方法与措施,为高效菌株的规模化生产提供参考。【方法】室内条件下,采用浸虫法,用浓度为1×107个孢子/mL球孢白僵菌悬浮液处理西花蓟马初羽化成虫,分别测定28株不同来源的菌株对西花蓟马的毒力;并将筛选出的4株高毒力菌株的分生孢子分别涂布于玉米琼脂（CMA）培养基与SDAY培养基上,比较不同菌株以及不同培养基之间产孢量的差异,筛选出高产孢菌株与产孢培养基,以筛选得到的白僵菌菌株为初始菌株F0,把F0代球孢白僵菌分别接种于CMA培养基、添加蝉蜕的CMA培养基和添加西花蓟马虫尸粉的CMA培养基,分别测定经过不同培养基连续5代继代培养得到的球孢白僵菌对西花蓟马成虫的毒力,并测定产孢量。使用模型模拟分析球孢白僵菌菌株经过不同培养基继代培养后培养代数与产孢量的关系,并对不同培养基培养得到的不同培养代数的白僵菌菌株的产孢量与其对西花蓟马的致死中时（LT₅₀）进行回归分析,研究毒力与产孢量的相关关系。【结果】经过室内毒力测定,处理5 d后,菌株DZDC-9、GZGY-5、WLMQ1-8、SZ-26对西花蓟马成虫的校正累积死亡率均高于90%,LT₅₀均在3 d内,毒力显著高于其他菌株;比较高毒力菌株在两种产孢培养基上的产孢量,发现4株球孢白僵菌的产孢量存在显著差异,菌株DZDC-9的产孢量显著高于其他3株,4株菌株在CMA培养基中的产孢量均明显高于SDAY培养基。随着白僵菌菌株在CMA培养基上连续5代的继代培养,菌株对西花蓟马成虫的致病力呈现下降趋势,从第3代开始致病力显著降低,而添加蝉蜕的CMA培养基培养得到的不同培养代数的分生孢子对西花蓟马致病力则没有显著差异,添加西花蓟马虫尸粉的CMA 培养基培养得到的不同代数的分生孢子对西花蓟马致病力有一定的增强趋势;通过模型可以发现单纯以CMA培养基继代培养白僵菌的产孢量随培养代数呈现指数下降,而在培养基中添加蝉蜕或西花蓟马虫尸粉白僵菌产孢量则随培养代数呈现指数上升,蝉蜕或西花蓟马虫尸粉的添加对产孢量有一定的增强作用。白僵菌菌株产孢量与毒力存在一定正相关关系,产孢量相对较高的菌株对西花蓟马成虫的致病力相对较高,致死中时短。【结论】筛选得到一株对西花蓟马高效的白僵菌菌株DZDC-9,产孢培养基中加入蝉蜕和西花蓟马虫尸可以维持菌株生长特性,延缓毒力退化趋势;同一菌株的产孢量可以作为菌株毒力评价的一个指标。     

邓恩桉继代增殖培养条件研究初报

为提高邓恩桉组培苗的增殖系数,降低组培苗生产成本,获得健壮的邓恩桉组培苗,通过不同基本培养基、谷氨酸、培养基不同pH值以及不同光照强度对邓恩桉继代培养增殖的影响试验,找到了邓恩桉的组织培养中继代增殖的适宜条件。结果表明,基本培养基、谷氨酸、pH值和光照强度对试管苗的继代增殖都会产生不同程度的影响。基本培养基以改良H为好,添加20mg/L的谷氨酸有利于试管苗的生长,pH值6.2最为适合,最合适的光照强度为2500lx。因此,适合邓恩桉继代增殖的培养条件为:改良H BA0.2～0.4mg/L NAA0.1～0.2mg/L IBA0.2mg/L LH500mg/L 谷氨酸20mg/L,pH6.2,光照强度2500lx。     

PSTVd，PLRV和PVS在马铃薯试管苗不同部位继代积累规律研究

 为研究病毒和类病毒在马铃薯试管苗不同部位的积累规律,利用实时荧光定量PCR和DAS-ELISA两种方法检测马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid, PSTVd)、马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus, PLRV)和马铃薯S病毒（Potato virus S, PVS）在马铃薯试管苗基部和顶端继代培养5代（继5代）后的含量。结果表明：PSTVd,PLRV和PVS在马铃薯试管苗常规组织培养过程中是逐代传递的,其在马铃薯试管苗顶端和基部的积累规律存在显著的品种差异,分别供试的7个品系中,存在PSTVd顶端积累和基部积累效应的各3个品系,存在PLRV顶端积累和基部积累效应的分别为4个和2个品系,存在PVS顶端积累和基部积累效应的分别为3个和2个品系,其中PSTVd的顶端积累效应最强为基部的4倍;同一马铃薯品系的顶端和基部对不同病毒和类病毒的积累趋势相对一致。实时荧光定量PCR是一种灵敏度很高的定量检测马铃薯病毒和类病毒的方法。     

福寿螺足组织和外套膜组织细胞培养的初步研究

采用改良的M199培养基,对福寿螺(Ampullaria gigas Spix)足组织和外套膜组织细胞进行了体外培养研究。结果显示:接种6 h后,细胞开始从组织块中迁出,培养至第3天,迁出细胞在组织块周围形成生长晕,第21~28天,细胞覆盖大部分培养瓶底壁。足组织和外套膜组织细胞分别被传至8代和9代。足组织和外套膜组织细胞在原代培养物中主要有两类,一为上皮样小细胞,形态为圆形、椭圆形或多边形,直径7~15μm;另一类为上皮样中型和大型细胞,形态椭圆形或多边形,直径15~30μm。上皮样小细胞数量多,增殖速度较快,在原代和传代培养的中后期皆可形成细胞单层。外套膜组织细胞的生长和增殖能力高于足组织细胞,其贴壁性也好于足组织细胞,Hoechst荧光染色显示外套膜组织细胞的细胞凋亡指数明显低于足组织细胞。结果表明,贝类外套膜组织有潜力成为建立连续细胞系的组织来源。     

L-茶氨酸对过氧化氢诱导山羊瘤胃上皮传代细胞凋亡的影响

本试验通过建立过氧化氢(H_2O_2)诱导山羊瘤胃上皮传代细胞凋亡模型,研究L-茶氨酸对H_2O_2诱导山羊瘤胃上皮传代细胞凋亡比率及其凋亡通路关键基因表达量的影响。选取42日龄湘东黑山羊的瘤胃上皮传代细胞,培养于含5%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基中,待细胞密度达到60%~70%时,随机分为5组,分别为培养基中无额外添加物的对照组、添加800μmol/L H_2O_2的Ⅰ组、添加800μmol/L H_2O_2+4 mmol/L L-茶氨酸的Ⅱ组、添加800μmol/L H_2O_2+8 mmol/L L-茶氨酸的Ⅲ组和添加800μmol/L H_2O_2+16 mmol/L L-茶氨酸的Ⅳ组,每组3个重复。作用12 h后,应用流式细胞术(FCM)检测山羊瘤胃上皮传代细胞凋亡比率,并采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)对山羊瘤胃上皮传代细胞凋亡通路关键基因半胱氨酸天冬氨酸-3(Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸-8(Caspase-8)、半胱氨酸天冬氨酸-9(Caspase-9)、Fas相关死亡域蛋白(FADD)和凋亡酶激活因子(Apaf-1)的表达量进行检测。结果显示:1)通过膜联蛋白-V(annexin V)/碘化丙啶(PI)联合染色结果可知,与Ⅰ组相比,各L-茶氨酸添加组(Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组)细胞晚期凋亡比率显著降低(P0.05),且细胞晚期凋亡比率随L-茶氨酸添加浓度的增加逐渐降低。2)通过RT-q PCR检测结果可知,与Ⅰ组相比,各L-茶氨酸添加组Caspase-3、Caspase-9、Apaf-1基因的表达量皆显著降低(P0.05)。由此得出,L-茶氨酸对H_2O_2引起的山羊瘤胃上皮传代细胞凋亡具有一定的保护作用,该结果可为今后研究反刍家畜瘤胃氧化应激损伤机制提供技术支持和理论参考。     

濒危植物香果树愈伤组织经长期继代后的6种同工酶研究

[目的]研究濒危植物香果树愈伤组织经长期继代后的6种同工酶酶谱的变化.[方法]采用非变性聚丙烯凝胶电泳技术对长期继代后的香果树愈伤组织的酯酶(EST)、酸性磷酸酯酶(ACP)、ATP酶(ATPase)、淀粉酶(AMY)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)6种同工酶进行分析.[结果]香果树的胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织在6种同工酶水平上均有差异,均可作为鉴别2者的依据.非胚性愈伤组织中的EST、ACP和POD的表达量明显高于胚性愈伤组织.褐化的非胚性愈伤组织与正常非胚性愈伤组织相比,在AMY、SOD和POD同工酶水平上无差别,而EST、ACP和ATP同工酶含量减少;褐化的胚性愈伤组织与正常胚性愈伤组织相比,EST同工酶含量升高,其他5种同工酶含量降低.[结论]为研究香果树的长期组织培养过程中愈伤组织形态差异及褐化现象提供理论基础. Abstract： [Objective] The aim was to study the changes of zymography in 6 kinds of isozymes after long-term subculture of Emmenopterys henryi Oliv..[Method]Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis was used to analyze isozyme patterns such as esterase (EST),acid phosphatase (ACP),ATP enzyme (ATPase),amylase (AMY),superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) in long-term subculture callus of Emmenopterys henryi Oliv. [Result] The research showed that there were differences among the 6 kinds of isozymes in embryogenic callus and non-embryogenic callus of Emmenopterys henryi Oliv.,and both levels could be taken as the basis for identification,the EST,ACP,and POD of non-embryogenic callus were significantly higher than embryogenic callus.The browning of non-embryogenic callus was non-level in the AMY,SOD and POD isozymes when was compared with normal non-embryogenic callus,while the EST,ACP and ATPase isozymes decreased;When the browning of embryogenic callus was contrasted with normal embryegenic callus,EST isozyme increased and the other 5 kinds of enzymes decreased. [Conclusion] The study provided theoretical basis for research morphological difference and browning of long-term tissue culture of Emmenopterys henryi Oliv..     

濒危植物香果树愈伤组织经长期继代后的6种同工酶研究

[目的]研究濒危植物香果树愈伤组织经长期继代后的6种同工酶酶谱的变化。[方法]采用用非变性聚丙烯凝胶电泳技术对长期继代后的香果树愈伤组织的酯酶（EST）、酸性磷酸酯酶（ACP）、ATP酶（ATPase）、淀粉酶（AMY）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）6种同工酶进行分析。[结果]香果树的胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织在6种同工酶水平上均有差异,均可作为鉴别2者的依据。非胚性愈伤组织中的EST、ACP和POD的表达量明显高于胚性愈伤组织。褐化的非胚性愈伤组织与正常非胚性愈伤组织相比,在AMY、SOD和POD同工酶水平上无差别,而EST、ACP和ATPase同工酶含量减少;褐化的胚性愈伤组织与正常胚性愈伤组织相比,EST同工酶含量升高,其他5种同工酶含量降低。[结论]为研究香果树的长期组织培养过程中愈伤组织形态差异及褐化现象提供理论基础。     

蓝莓丛生芽增殖的诱导研究

利用两种优良成龄蓝莓的茎段腋芽为外植体,研究了基本培养基、植物生长调节剂对诱导蓝莓丛生芽增殖的影响,剪除丛生芽对诱导新一代丛生芽增殖的影响,同时进行了试管微芽继代增殖培养.结果表明:南高丛蓝莓丛生芽最佳诱导增殖培养基为WPM+ ZT 2.5 mg/L,试管微芽继代增殖最适培养基为WPM+ZT 0.3 mg/L;兔眼蓝莓丛生芽最佳诱导增殖培养基是WPM-A+ZT 2.5 mg/L,试管微芽继代增殖最佳培养基是WPM+ZT 2.0 mg/L.剪除丛生芽对诱导新一代丛生芽具有较显著促进作用.     

樱桃番茄‘秋香’组织培养快繁技术研究

以温室种植的‘秋香’番茄健壮幼嫩侧芽为材料,研究4种不同消毒方法对番茄外植体的消毒效果,并通过继代培养,进一步研究并筛选‘秋香’番茄组织培养最佳培养基。试验结果表明:外植体消毒效果较理想的方式是10%的NaClO溶液(v/v)消毒20min,后用0.1%HgCl_2溶液(w/v)+2滴吐温20消毒3min;无菌株系建立适合的培养基为MS+BA 0.1mg·L~(-1)+IBA 0.1mg·L~(-1);继代培养适宜培养基配方为MS+BA0.1mg·L~(-1)+IBA 0.5mg·L~(-1),可以较快获得健壮的‘秋香’番茄试管苗。     

籼稻YTB成熟胚愈伤组织继代培养条件试验

为确定籼稻YTB成熟胚愈伤组织继代培养的最佳条件,对籼稻愈伤组织进行不同继代培养条件优化组合试验,研究不同因素对籼稻愈伤组织继代培养的影响。结果表明:NB培养基是较适合籼稻愈伤组织继代生长的培养基;籼稻YTB成熟胚愈伤组织不适合二次继代;铁盐浓度对籼稻愈伤组织的继代培养有明显影响;水解酪蛋白、脯氨酸、谷氨酰胺及硫代硫酸钠等能改善籼稻愈伤组织的质量,降低褐化率;抗坏血酸(VC)对籼稻胚愈伤组织的继代生长及抗褐化无明显影响;形态学观察和细胞学观察的一致性证明了外源腐胺PUT(30 mg/L)在籼稻愈伤组织继代培养中可以使愈伤组织保持良好的胚性,从而提高后续遗传转化的转化率。