玉米大斑病菌分生孢子形成的影响因素及GATA转录因子家族的表达分析

【目的】玉米大斑病(northern leaf blight of corn)是由玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)引起的一种威胁玉米生产的重要叶部病害。本研究旨在确定影响玉米大斑病菌分生孢子产量的主要因素;明确GATA家族成员基因在分生孢子形成时期的表达特征,为深入解析调控病菌发育及致病的分子机制打下基础。【方法】以玉米大斑病菌野生型菌株01-23为试材,探索13种不同培养基(乳糖酪蛋白琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、玉米茎秆葡萄糖琼脂培养基、玉米茎秆琼脂培养基、玉米叶片葡萄糖琼脂培养基、玉米叶片琼脂培养基、玉米籽粒葡萄糖琼脂培养基、玉米籽粒琼脂培养基、玉米粉葡萄糖琼脂培养基、玉米粉琼脂培养基、查氏培养基、基本培养基、水琼脂培养基)、5种碳源(乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖)、以乳糖酪蛋白琼脂培养基为基础培养基,以5 g·L~(-1)的量分别添加不同的氮源(牛肉膏、蛋白胨、NH_4Cl、KNO_3、(NH_4)_2SO_4、NH_4NO_3)、pH(4、5、6、7、8、9)、温度(15、20、25、30、35℃)及光照强度(1 500、3 000、6 000、9 000 lx)等条件对分生孢子产量的影响;进一步利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术,分析病菌菌丝形成时期和分生孢子形成时期GATA家族5个成员基因的表达量。【结果】利用单因素分析法确定了影响玉米大斑病菌分生孢子产量的主要因素,发现产孢量最大的培养条件为玉米叶片葡萄糖琼脂培养基,碳源为乳糖,培养温度为25℃,pH 8,光照条件为光暗交替各12 h,光照强度为6 000 lx。另外,还发现在培养基中添加KNO_3可显著提高分生孢子产量。对GATA家族5个基因的相对表达水平分析表明,与菌丝时期相比,在分生孢子形成时期GATA2的表达量明显上调,其他基因(GATA1、GATA3、GATA4、GATA5)表达量均显著下调。【结论】利用单因素分析法确定了影响玉米大斑病菌分生孢子产量的最佳培养条件;根据GATA家族5个基因相对表达分析结果,推测GATA2可能参与了玉米大斑病菌的分生孢子形成。     

柑桔黑腐病菌生长和产孢生物学研究

本试验研究了柑桔黑腐病菌Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｃｉｔｒｉ菌丝生长和分子孢子形成条件,结果表明：病菌在２７℃菌丝生长最快,在３０℃产孢最多;甘露糖是最好的碳源,Ｄ－缬氨酸是最好的氮源,Ｃｚａｐｅｋ培养基是菌丝生长最适宜的培养基,桔叶汁培养基是产孢的最适宜培养基。     

绿色木霉菌固体发酵培养基优化组合正交筛选

以测定绿色木霉菌产孢量和分生孢子萌发率为指标,分析比较了5种单一固体培养基和7种一般组合固体培养基的发酵结果,初筛出单一培养基玉米碎粒、稻壳和麸皮以及一般组合培养基玉米碎粒+麸皮+稻壳+脲为基本培养基。在此基础上选取玉米碎粒、麸皮、稻壳、脲为4个组分因子进行不同配比的正交试验,筛选出6号为最佳组合配方,其分生孢子量最高为9.90×10¹⁰个/g,比初筛出的最佳基本培养基麸皮+脲(3.37×10¹⁰个/g)提高约3倍,孢子萌发率为95.01%。     

PhoR/PhoP双组分系统对枯草芽胞杆菌NCD-2菌落形态和芽胞形成的影响

 双组分PhoR/PhoP是枯草芽胞杆菌中普遍存在的以低磷为信号的调控系统。前期研究发现,PhoR/PhoP双组分系统正调控枯草芽胞杆菌NCD-2菌株脂肽类抗生素fengycin的合成,本研究分析了PhoR/PhoP双组分系统对NCD-2菌株菌落形态和芽胞形成的影响。在有机磷培养基上,NCD-2野生型菌株可以降解有机磷并且形成表面褶皱、立体结构较强的菌落形态,而phoR或phoP基因突变子丧失了降解有机磷的能力,菌落表面光滑、平坦。phoR和phoP基因突变子的互补菌株恢复到了与野生型相似的解磷能力和菌落形态。在低磷和高磷培养基中比较了NCD-2野生型及其衍生菌株的生长及芽胞形成情况,结果表明,在高磷培养基中,NCD-2野生型及其衍生菌株的生长速率没有差异,但在低磷培养基中,phoR和phoP基因突变子的菌体生长速率显著降低。芽胞形成能力测定结果表明,在低磷培养基中,NCD-2野生型菌株的芽胞形成率较高,而phoR和phoP基因突变子的芽胞形成率显著降低;在高磷培养基中,NCD-2野生型及其衍生菌株芽胞形成率普遍较低并且无显著差异。RT-PCR分析显示, phoR和phoP的突变均显著降低了芽胞形成相关基因spo II GA的表达,相比感应激酶PhoR,调控因子PhoP对spo II GA基因的影响更显著。     

响应面法优化绿色木霉H06产孢培养条件

在单因素试验的基础上,采用响应面法(response surface methodology,RSM)对绿色木霉菌H06菌株产孢培养条件进行了优化.首先利用Plackett-Burman试验设计筛选出影响产孢的3个主要因素:装液量、接种量和培养温度.在此基础上运用最陡爬坡路径法逼近最大响应值区域,最后利用响应面分析法确定主要因子之间的交互作用及最佳条件.结果显示,绿色木霉H06菌株的最佳发酵条件为:转速200 r/min,装液量74.70 mL/250mL,接种量5.83％,pH 7.5,温度29.50℃,培养时间72 h,菌龄48 h.H06菌株最大理论孢子含量为7.64×109个/mL.经3次平行试验验证,实际平均孢子含量与预测孢子含量相近,比之前的孢子含量提高133％.     

黄瓜褐斑病菌产孢条件的研究

对黄瓜褐斑病原菌产孢条件进行了研究,结果表明:在不同的培养基上多主棒孢霉菌产孢量存在显著差异,PDA+黄瓜叶片和Richard培养基有利于产孢,碳源麦芽糖、氮源硫酸铵和蛋白胨有利于产孢,光照和紫外线照射可促进产孢,其中在紫外线照射60~80 min时产孢量达到最大;温度为30℃,pH 5~pH 7最有利于产孢.     

烟粉虱病原真菌IfB01菌株的鉴定及产孢条件优化

【目的】对从烟粉虱上分离的If B01菌株进行分类学鉴定并优化其产孢条件.【方法】采用形态学、ITS1-5.8SITS2 rDNA和β-微管蛋白基因序列同源性分析方法鉴定该菌株;比较不同培养基、培养基含水量、pH、接种量与金属元素对分生孢子产量的影响,优化产孢条件.【结果和结论】该菌株菌落形态、分生孢子及产孢结构与玫烟色棒孢霉Isaria fumosorosea相似,其ITS1-5.8S-ITS2 rDNA和β-微管蛋白DNA序列与玫烟色棒孢霉和爪哇拟青霉Paecilomyces javanicus相似性高于97%,将该菌株鉴定为玫烟色棒孢霉.培养基配方对If B01菌株分生孢子产量影响显著,玉米粉+麦麸混合培养基产孢量最多,1 g培养基产孢量为6.07×109;麦麸∶玉米粉质量比为5∶5、培养基含水量(w)为42%、接种量为6 m L菌液时,其产孢量最高;该菌株对pH的适应范围较广,pH 5~8时,都有较好的产孢量;金属元素对产孢无促进作用,且镁、铁、钠和钙对If B01产孢均有抑制作用.     

不同培养基对禾草内生真菌Epichlo(e)生长与产孢的影响

本研究以分离自西藏早熟禾(Poa tibetica)、甘肃臭草(Melica przewalskvi)和麦宾草(Elymus tangutorum)的6个内生真菌菌株(分别为西藏早熟禾内生真菌Ep-003和Ep-004,甘肃臭草内生真菌Em-014和Em-016,麦宾草内生真菌Ee-001和Ee-003)为研究对象,分别在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)、麦秆煎液琼脂(WSA)、玉米粉琼脂(CMA)和水琼脂(WA)4种培养基上培养4周后,观测菌落生长速率、菌落形态特征、产孢量和孢子特性.结果表明,同一菌株在不同培养基上的生长速率一般为PDA和CMA上的最大,WSA和WA上最小;不同菌株在同一培养基上,西藏早熟禾的Ep-003菌株生长最快,在PDA上直径最大,为46.42 mm,麦宾草内生真菌次之,甘肃臭草的Em-014菌株生长最慢,在WA上直径最小,为7.07 mm;在4种培养基上,菌株的产孢量有显著差异(P＜0.05),分别为Ep-003只在WA上产孢,其他5种菌株在WA和WSA培养基上产孢较多,在PDA和CMA上产孢较少;Em-016和Ep-004在4种培养基上的孢子长度无显著差异(P＞0.05),Em-014在WSA上的孢子长最小,为3.77 μm,其他菌株无显著差异(P＞0.05),Ee-003在PDA上孢子长最长,为8.43 μm,在其他3种培养基上无显著差异(P＞0.05);Ep-004、Em-016和Ee-003在4种培养基上孢子梗长度均无显著差异(P＞0.05),Em-014在WA上孢子梗最长,为16.74 μm,在WSA上最短,为14.09 μm,Ee-001在CMA上孢子梗最长,为18.59 μm,在WSA上最短,为13.40 μm.     

白芷斑枯病病菌的生物学特性研究

首次较系统地研究白芷斑枯病菌的生物学特性,结果表明:菌丝生长和产孢的温度范围为10~35℃,最适温度为25℃;最适pH5~7;病菌在PDA培养基上能够很好的生长和产孢;对碳源的利用以双糖最佳,对氮源的利用以无机氨态氮最好;光照对病菌的生长和产孢无显著影响。分生孢子在无菌水中的萌发率极低,加入糖分或寄主汁液可显著提高孢子的萌发率;分生孢子萌发的温度范围为10~35℃,最适温度为25~28℃;相对湿度93%以上孢子才能萌发,以RH100% 水中孢子萌发率最高;pH5~7最有利于孢子萌发。在最适条件下,病菌孢子8 h开始萌发,24 h萌发率达到90%以上。光照对分生孢子的萌发无显著影响。分生孢子的致死温度为50℃(10 m in)。     

简青霉CEF-818固体发酵工艺优化

简青霉Penicillium simplicissimum CEF-818发酵产物能够有效的防治由大丽轮枝菌Verticillium dahliae引起的棉花黄萎病,为获得简青霉CEF-818最佳的发酵条件,本研究采用单因素和正交试验方法对简青霉CEF-818固体发酵培养基的组成以及发酵条件进行了优化。结果表明,简青霉CEF-818固体发酵最适培养物为麦麸,其他添加物为葡萄糖、尿素和氯化钾,添加量按麦麸的质量比分别为2.5%、0.6%和0.6%（M/M）,料水比为1：0.5,固体发酵最佳的培养条件为液体接种量为5%（V/M）、初始pH为7、物料厚度为2 cm、培养温度为28℃、培养时间为7 d。在此条件下,简青霉CEF-818的产孢量为8.28×10⁹ CFU/g。