草菇gpd启动子的克隆及表达载体的构建

从草菇基因组中克隆内源强启动子,为草菇基因工程育种提供启动子元件材料。［方法］采用PCR技术从草菇基因组DNA中克隆gpd启动子片段,利用生物信息学手段对其序列特征和调控元件进行分析,并构建表达载体。［结果］从草菇基因组中克隆出2条特异gpd启动子片段,大小分别为1056和614bp;成功构建了分别以这2条启动子片段驱动的、以gfp基因为报告基因的2个表达载体。［结论］该研究为进一步利用基因工程手段培育品质优良的草菇新菌株奠定了基础。     

不同启动子在水稻悬浮细胞中诱导外源基因的表达

为进一步提高外源基因在水稻悬浮细胞中的表达水平,以花椰菜花叶病毒(Ca MV)35S启动子为对照,克隆了玉米泛素蛋白启动子(Ubi)、水稻肌动蛋白启动子(Actin)以及水稻Oscc1启动子,以GFP为报告基因,通过启动子串联的方式,构建了10个植物表达载体:p CAMBIA 1304 35S-GFP、Ubi-GFP、Actin-GFP、Oscc1-GFP、35S/Ubi-GFP、35S/Actin-GFP、35S/Oscc1-GFP、Ubi/Actin-GFP、Ubi/Oscc1-GFP、Actin/Oscc1-GFP,采用根瘤农杆菌介导的方法,将表达载体导入日本晴胚性愈伤,经悬浮培养分别获得转基因的悬浮细胞系,利用荧光显微镜、酶标仪检测GFP荧光强度,用Western blot检测GFP蛋白质的表达水平。结果发现串联启动子明显强于单个启动子驱动的GFP蛋白质表达水平。在10个表达载体中,35S/Ubi、Ubi/Actin和Ubi/Oscc1是3种优化的启动子组合,其中Ubi/Oscc1串联启动子驱动GFP的表达水平最高,约为对照35S启动子的3倍。     

水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子的克隆与鉴定

[目的]获得有效的水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子序列,为开展水牛源细胞的基因特异沉默研究奠定基础.[方法]通过启动子上、下游保守序列对水牛源启动子7SK、U6进行克隆和启动子关键顺式作用元件识别,利用一段针对EGFP的shRNA片段（shEGFP）对水牛7SK、U6启动子进行功能性分析,然后分别在水牛源及鼠源细胞中与pEGFP-N1共转染,转染48h后用荧光显微镜检测EGFP的表达情况,并用流式细胞仪和荧光实时定量PCR检测EGFP沉默表达情况.[结果]克隆获得水牛7SK、U6启动子序列分别为430和357 bp,其OCT-1（或CACCC盒）及TATA盒高度保守.连接shEGFP后与pEGFP-N1共转染细胞,通过荧光显微镜可观察到细胞发生了明显的荧光表达沉默现象;通过流式细胞分析,发现水牛7SK和U6启动子引导的shEGFP在水牛源细胞中沉默效率高达93.82％和87.45％;荧光实时定量PCR检测结果显示,在转染bu7SK-shEGFP和buU6-shEGFP的水牛源BFF细胞中,EGFP表达水平均显著低于其他物种启动子的细胞转染组（P＜0.05）,而在鼠源PT67细胞中,水牛启动子的启动效率与其他物种启动子差异不显著（P＞0.05）.[结论]水牛7SK和U6启动子可高效启动shRNA表达,且具有一定的物种特异性.     

甘蓝型油菜WRI1基因cDNA克隆与种子特异性表达载体的构建

WRI1基因所编码的转录因子参与糖酵解和脂肪酸合成,在种子油的积累过程中起着关键作用。在种子中超表达WRI1基因,对提高油菜种子含油量具有重要意义。本研究利用RT-PCR技术,从甘蓝型油菜湘油15号cDNA中分离克隆了5个WRI1基因全长cDNA序列,选取2种存在明显差异(碱基缺失)的cDNA序列构建植物种子特异性表达载体。为后续转基因研究这种差异是否会造成WRI1基因在提高含油量作用上的差异作准备。通过双酶切和连接反应,分别将WRI1基因和napin启动子基因插入到pBI121载体的GUSA基因和CaMV35启动子基因位置。酶切及PCR检测结果显示,napin启动子和WRI1已插入相应位置,完成2种载体种子特异性表达WRI1基因重组载体pBI121+napin+WRI1的构建,命名为pBI121NW2、pBI121NW4。     

不同硒源对刺参呼吸代谢的影响

为了研究不同硒源对刺参Apostichopus japonicus特定生长率和呼吸代谢指标的影响,以刺参幼参和成参为研究对象,分别强化投喂硒添加量为0.6 mg/kg的硒代蛋氨酸、硒酸钠和亚硒酸钠饲料,试验周期为60 d。结果表明:硒添加组成参和幼参的特定生长率均显著大于对照组(P0.05),其中硒代蛋氨酸组最大,且显著大于硒酸钠组和亚硒酸钠组(P0.05),除硒代蛋氨酸组外,其他各试验组成参的特定生长率均大于幼参;硒添加组成参和幼参的耗氧率均显著大于对照组(P0.05),其中硒代蛋氨酸组最小,显著小于硒酸钠组和亚硒酸钠组(P0.05),对应组中,幼参耗氧率大于成参;硒添加组成参和幼参的排氨率均低于对照组,除硒代蛋氨酸组成参显著低于对照组(P0.05)外,其余硒添加组与对照组均无显著性差异(P0.05),硒代蛋氨酸组的排氨率最小,对应组中,幼参排氨率大于成参;硒添加组成参和幼参的O/N值均显著大于对照组(P0.05),其中硒代蛋氨酸组最小,但硒添加组间无显著性差异(P0.05),对应组中,成参的O/N值大于幼参。研究表明,饲料中添加硒能够提高刺参的代谢率,促进刺参生长,其中有机硒(硒代蛋氨酸硒)的促生长效果好于无机硒(硒酸钠和亚硒酸钠),且硒代蛋氨酸对幼参的促生长效果要好于成参。     

玉米转录因子EREB58启动子分析

玉米EREB58转录因子能够调控萜类合成酶基因TPS10的表达,启动玉米抗虫间接防御体系。但是目前对于EREB58的转录调控机制还是未知。克隆得到EREB58基因的1 193 bp的启动子序列,通过生物信息学分析发现在启动子序列中存在多个与植物防御相关的顺式作用元件,如ABRE、Box-W1、GARE motif和TCA元件。将不同长度5’端缺失的启动子与GUS报告基因相连构建植物表达载体转化拟南芥,转基因拟南芥进行GUS组织化学染色和GUS酶活性分析,结果显示:正常情况下EREB58PF1-PF7和PF9无GUS染色,但PF8有GUS染色;Me JA或亚洲玉米螟处理后PF1-PF7有GUS染色,PF8无明显变化,PF9仍无GUS染色。GUS酶活性分析与GUS组织化学染色结果一致。以上结果表明:EREB58启动子的-323至-270和-270至-183区段是启动子的功能区段,且-323至-273区段含有抑制EREB58基因转录的顺式作用元件,-273至-183区段是EREB58基因转录所必需的,这为后续研究EREB58的转录调控机制奠定基础。     

田间“限氧喷雾”制备生物炭技术与炭质表征

生物炭具有改良土壤、固碳减排、吸附重金属和有机污染物等方面的有益作用,但其农业和环保应用面临着成本过高这一瓶颈问题.在田间直接将生物质转化为生物炭,可节省原材料收集与炭品运输等环节的费用,降低使用成本.可通过喷雾技术在田间限氧条件下实现生物炭的制备,其工艺如下:物料在槽内经逐层压实后,采用单向引燃、逐次喷雾的方式辅助竹柳和棉秆成炭;采用多位点引燃、逐层喷雾的方式辅助芦苇成炭.制炭期间,土槽中的侧壁开孔方管起通气和限氧作用以控制适燃,铁质密网起限氧、防尘和提供喷雾通道等作用以控制成炭.采用该技术制备的生物炭表现出了较好的同槽均质性和异槽同质性,成炭率达30%,制备得到的炭含有丰富的羧基(0.71～1.43 mol/kg)、酚羟基(0.43～1.09 mol/kg)官能团,且具有较大的比表面积(45.5～83.2 m~2/g).田间"限氧喷雾"技术为生物炭的制备提供了新的思路和技术选项,也为其农业和环保应用创造了条件.     

不同温度下扶桑绵粉蚧试验种群生命表研究(英文)

[目的]揭示温度对扶桑绵粉蚧种群动态的影响,为该虫的防治提供帮助。[方法]建立试验种群,并用棉花饲养,观察记录种群的主要参数。[结果]组建了24、27、30℃下扶桑绵粉蚧试验种群特定年龄和繁殖力特征生命表,获得了该虫世代平均历期、各虫期/年龄存活率、寿命、产卵期、单雌产卵量、性比、净增值率、内禀增长率、周限增长率、种群增长趋势指数、存活率曲线类型、日产雌量曲线类型等10余个实验种群参数,揭示了温度对该粉蚧生长发育、寿命和生殖力的影响。[结论]在适宜温度条件下,扶桑绵粉蚧繁殖潜力大,种群增长速度快,易暴发成灾。该研究结果为扶桑绵粉蚧的种群动态调查、预测预报和综合治理等提供了科学依据。     

水稻OsN1基因5’端启动子不同区域序列分析

为了研究水稻OsN1基因启动子(OsN1p)的表达调控机理,用OsN1基因ATG(ATG中的A为0)上游-1 089 bp、-881 bp、-489 bp和-245 bp的启动子序列分别取代pBI121中的35S启动子,构建植物表达载体pBIN1.1p、pBIN0.9p、pBIN0.5p和pBIN0.2p。将这些表达载体经农杆菌介导转化水稻日本晴,获得转基因植株。对启动子的表达特点和启动活性进行了分析,结果表明,由-1 089 bp启动子、-881 bp启动子和-489 bp启动子驱动的gus基因能在愈伤组织中表达,-245 bp启动子不能驱动gus基因在愈伤组织中表达,说明启动子OsN1p具有启动活性的最小启动序列为ATG上游的-489 bp;-489 bp启动子驱动的gus基因在转基因植株根中表达,在根冠不表达;用5 mmol/L水杨酸(SA)喷施转基因植株叶片后,GUS定量分析结果表明转基因植株的GUS活性增高,转-881bp启动子植株的GUS活性比转-1 089 bp启动子植株的活性高。可见,启动子OsN1p具有组织特异性表达和受SA诱导表达的特性。     

小鼠胞内氯离子通道5基因启动子核心功能区域鉴定及转录调控分析

为研究胞内氯离子通道5基因(Chloride intracellular channel 5,CLIC5)广泛参与调节细胞内的各项生理活动与生化反应,并探讨该基因自身的表达调控机制,以小鼠基因组序列为模板,利用PCR技术扩增小鼠CLIC5基因5′上游调控序列,将其插入荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中,同时采用5′侧翼区缺失的方法构建了7个缺失不同DNA片段的荧光素酶表达载体。重组质粒与海肾荧光素酶载体(phRL-TK)共同瞬时转染HEK-293细胞,经双荧光素酶报告基因活性分析后,确定CLIC5基因的核心启动子区。利用生物信息学方法预测其中转录因子结合位点及启动子区甲基化状况。结果表明,CLIC5基因启动子缺乏TATA盒,但含有典型的GC盒及其他潜在转录因子结合位点;双荧光素酶报告基因活性分析表明,CLIC5基因-329～+1、-624～+1、-917～+1和-2 230～+1区域的启动子活性较高,其中-624～+1区域的启动子活性最强。进一步分析表明,启动子区-624～-329存在负性调控元件,预测存在转录因子结合位点RXR heterodimer binding sites与GC-Box factorsSp1/GC,-420～-283范围内存在CpG岛位点。