冬瓜 WRKY 基因家族鉴定及表达分析

【目的】WRKY转录因子家族在植物生长发育、抵御胁迫等过程起着至关重要的作用。挖掘参与冬瓜（Benincasa hispida Cogn.）非生物胁迫的WRKY基因家族成员,探究其生物学功能。【方法】基于冬瓜基因组数据库鉴定冬瓜WRKY成员,利用生物信息学的方法系统分析其WRKY基因家族成员的蛋白理化性质、系统发育、保守基序、顺式作用元件,通过qPCR分析冬瓜WRKY的表达情况。【结果】冬瓜WRKY基因家族有57个成员,氨基酸数目在126～650之间,相对分子质量在13.92～71.68 kD之间;蛋白等电点在4.61～9.69之间。根据系统进化树将该家族分为3个类群,第二类群又分为5个亚组。冬瓜WRKY外显子有2～6个。染色体定位分析发现,有56个基因定位在12条染色体上,1个基因未定位在染色体上。保守基序分析显示,Motif 1和Motif 3存在于56个基因,且同一类群具有类似的保守基序结构。同时,冬瓜WRKY基因的启动子上均含有应激反应相关元件、激素响应元件。WRKY在冬瓜不同组织和果实发育时期特异表达。RT-PCR结果表明非生物胁迫和激素处理冬瓜可诱导部分WRKY基因的表达。...     

蚓激酶基因乳腺表达载体构建及在牛乳腺中的瞬时表达

在稀有密码子的改造基础上,人工合成了849 bp的蚓激酶F-Ⅲ-1全长cDNA序列,并以其为目的基因,构建了以山羊β-酪蛋白启动子为上游调控序列的乳腺组织特异性表达载体pBLK和pLN-bCP-LK。2种质粒分别以200,500,1 000,2 000μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,以纤维蛋白平板溶圈法(FAPA)检测该基因表达后奶样的纤溶活性。结果表明:注射后3~78 h,奶样有明显纤溶活性,其中6~16 h活性最高。500μg pBLK质粒与其他3个剂量溶圈直径之间差异显著(P<0.05),而其他3个剂量之间差异不显著;pLN-bCP-LK质粒的各剂量溶圈直径之间差异均不显著,且2种质粒的同剂量溶圈直径之间差异也不显著。以上结果表明,改造后的蚓激酶基因可以在泌乳期黑白花奶牛乳腺中实现瞬时表达,以500μg的注射剂量表达效果最佳。     

茶树亲环素基因cDNA全长的分析鉴定与原核表达

通过对茶树新梢cDNA文库大量随机测序,获得了一个编码亲环素的全长基因,在GenBank登录,登录号为DQ904327。茶树亲环素基因cDNA全长949 bp,其中开放阅读框全长495 bp,编码蛋白质含有164个氨基酸,分子量约为17.47 kD,等电点约为8.54,它具备5’端非编码区的“CAAT”标志及3’端非编码区的”AATAAA”poly-A加尾信号。其推测的氨基酸序列经与26条其他生物亲环素蛋白氨基酸序列进行CLUSTAL W多序列联配并以Neighbor-Joining法进行进化树构建后,发现与水稻和小麦的相似性较高,达到85%以上。根据亲环素基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达载体pET/Csin-Cyp,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导出了一个分子量为23 kD的亲环素融合蛋白。     

筇竹QtKAT1基因的克隆与表达分析

为探究竹类植物K+调控机理及K+通道的系统,本研究以筇竹(Qiongzhuea tumidinoda)为试验材料,对筇竹QtKAT1基因分离克隆及表达分析.通过克隆获得筇竹QtKAT1基因,全长为3 124bp,含2 235 bp的最大开放阅读框,编码744个氨基酸.生物信息学分析表明QtKAT1基因预测编码蛋白分子质...     

Exogenous application of melatonin improves plant resistance to virus infection

In this study, melatonin (MEL)-mediated plant resistance to tobacco mosaic virus (TMV) was examined to study local infection in Nicotiana glutinosa and systemic infection in Solanum lycopersicum. Exogenous application of 100 µm MEL increased anti-virus infection activity to 37.4% in virus-infected N. glutinosa plants. The same treatment significantly reduced relative levels of virus RNA analysed by qRT-PCR and virus titres measured by dot-ELISA, and increased the relative expression levels of the PR1 and PR5 genes analysed by qRT-PCR, in virus-infected S. lycopersicum. MEL treatment induced considerable accumulations of salicylic acid (SA) and nitric oxide (NO) but did not significantly affect production of hydrogen peroxide (H₂O₂) in the virus-infected S. lycopersicum plants. Transgenic nahG N. tabacum was used to determine whether MEL-induced TMV resistance was dependent on the SA pathway. The results showed that the relative RNA level of the TMV analysed by qRT-PCR and virus titres analysed by dot-ELISA were not reduced by the MEL treatment in the nahG transgenic N. tabacum seedlings treated twice with 100 µm MEL. The increased relative expression levels of PR1 and PR5 were greatly reduced when cPTIO, an NO scavenger, was included in the MEL treatment. A working model of MEL-mediated plant resistance to TMV is proposed. MEL-mediated plant resistance to viruses provides a new avenue to control plant viral diseases.     

棉铃虫脂肪酸结合蛋白的克隆与表达

为深入了解棉铃虫Helicoverpa armigera脂肪酸结合蛋白HaFABP1在参与细胞内脂肪酸代谢过程中的功能,基于酵母单杂交结果从幼虫中肠cDNA中扩增得到HaFABP1的开发阅读框,构建重组菌株BL21-pET28a-HaFABP1,进行融合蛋白His-HaFABP1的诱导和纯化,并利用实时荧光定量PCR检测棉铃虫不同时期和组织中HaFABP1的表达规律,最后检测2-十三烷酮处理下棉铃虫6龄幼虫中肠组织内HaFABP1的变化情况。结果显示,克隆获得的棉铃虫HaFABP1为405 bp,编码134个氨基酸,相对分子量和等电点分别为15.08 kD和5.54;在37℃下用0.5 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌株4 h后,得到约18.4 kD的可溶性蛋白His-HaFABP1,纯化后的融合蛋白条带单一且大小符合预期;HaFABP1在棉铃虫的脂肪体、中肠、体壁和头部中都有表达,在头部的表达量最低,在中肠中的表达量最高;HaFABP1在棉铃虫幼虫的每个发育时期都有表达,表达量总体呈现先降低后升高的趋势,4龄时最低而1龄时最高;10 mg/g 2-十三烷酮处理饲料饲喂棉铃虫6龄幼虫6 h和15 h后,中肠内HaFABP1的表达量与对照相比显著提高,且随着时间的延长逐渐增加。表明HaFABP1与棉铃虫的生长发育有关,并且有可能参与了昆虫的解毒过程。     

温度胁迫下沙葱萤叶甲小热激蛋白基因GdHsp20.6的克隆及表达分析

为明确小热激蛋白在沙葱萤叶甲Galeruca daurica应对温度胁迫中的作用,采用PCR方法克隆沙葱萤叶甲小热激蛋白基因Hsp20（GdHsp20.6）完整的开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,应用在线软件对GdHsp20.6基因进行生物信息学分析,通过原核表达技术诱导表达及纯化其编码蛋白,并通过实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）技术分析不同温度胁迫下GdHsp20.6基因的表达量。结果显示,GdHsp20.6基因ORF序列长度为543 bp,编码180个氨基酸,预测分子量为20.6 kD,无跨膜区和信号肽。GdHsp20.6氨基酸序列有高度保守的α-结构域。GdHsp20.6氨基酸序列与其它鞘翅目昆虫的Hsp20氨基酸序列有较高的一致性,其中与花绒寄甲Dastarcus helophoroides的Hsp20.99氨基酸序列的一致性最高,为63%。GdHsp20.6基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）细胞系中成功表达,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG）诱导后GdHsp20.6蛋白成功表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和Western-blot分析表明融合蛋白大小与预测大小一致,并纯化获得了纯度较高的目的蛋白GdHsp20.6。低温（-10~5℃）和高温（35~40℃）处理1 h以及处理后25℃恢复30 min均能诱导GdHsp20.6基因表达上调,并且0℃处理30~120 min也能诱导GdHsp20.6基因表达上调。表明GdHsp20.6基因在沙葱萤叶甲应对低温和高温胁迫中可能起着重要作用。     

Q型烟粉虱芳香基硫酸酯酶B基因的克隆及表达分析

为明确烟粉虱Bemisia tabaci取食感染番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)的番茄植株后,其体内的芳香基硫酸酯酶B基因(arylsulfatase B,ARSB)是否能够做出应答反应,基于Q型烟粉虱基因组数据克隆得到ARSB基因cDNA全长,采用生物信息学方法分析其序列特征,并通过实时荧光定量PCR技术测定ARSB基因在Q型烟粉虱不同发育阶段、不同组织及携带TYLCV前后的表达量变化情况。结果显示:Q型烟粉虱ARSB基因的cDNA全长为1 731 bp,编码576个氨基酸,分子量为64.89 kD,具有ARSB的保守结构域。ARSB基因在Q型烟粉虱不同发育阶段均有表达,在卵期表达量最高,成虫期表达量最低;该基因在Q型烟粉虱头胸部的表达量显著高于腹部;Q型烟粉虱获取TYLCV 72 h后其体内ARSB基因表达量显著提高。表明ARSB基因在Q型烟粉虱不同龄期、不同组织内存在差异表达,并可能参与Q型烟粉虱对TYLCV的响应和传毒过程。     

鸡粪及其配施尿素对甜瓜香味物质、酶活性及基因表达的影响

为了探讨鸡粪以及鸡粪与尿素配施对薄皮甜瓜果实香气物质合成及关键酶的影响,以薄皮甜瓜"DX108"为试材,以尿素为氮源的处理作为对照(CK),研究等量氮素条件下,鸡粪及其与尿素配施处理对甜瓜果实香气物质以及相关酶活性变化的影响,并分析了乙醇脱氢酶(ADH)和醇酰基转移酶(AAT)基因的表达水平。结果表明:不同处理对薄皮甜瓜香气物质合成、相关酶活性以及关键酶基因表达的影响存在明显差异;尿素处理促进了甜瓜果实中C6和C9醇醛类化合物的合成,而鸡粪以及鸡粪与尿素配施提高了成熟果实中酯类物质含量和种类,尤其是乙酸酯类含量;鸡粪配施尿素处理提高了花后35 d甜瓜果实中非乙酸酯类物质含量,且是尿素处理花后35 d甜瓜果实中非乙酸酯类物质含量的3.1倍,还检测到了尿素处理果实中没有检测到的特征性酯类物质;鸡粪和鸡粪配施尿素处理提高了花后25～30 d果实中LOX酶、氨基转移酶、ADH酶以及AAT酶活性,降低了花后35 d果实中ADH酶活性,抑制了30 d后果实中CmADH1和ADH2的基因表达,而促进了CmAAT1和CmAAT3基因表达。由此可知,鸡粪以及鸡粪与尿素配施有可能是通过调节果实不同发育期香味物质合成途径中关键酶活性的协调变化以及关键酶基因表达,影响了果实香气物质的合成,尤其是酯类物质的合成。     

中国辣椒BCAT基因家族鉴定、表达分析及克隆

【目的】了解中国辣椒（Capsicum chinense Jacq.）BCAT基因家族成员的分布、性质及表达模式。中国辣椒是辣椒的5个主要栽培种之一,果实通常具有由支链酯类形成的浓郁果香。支链氨基酸转氨酶（BCAT,Branched-chain Aminotransferase）负责催化支链氨基酸合成相应2-氧代酸,是催化合成支链酯类的第一步反应酶。【方法】使用生物信息学分析和实时荧光定量PCR等方法对中国辣椒的BCAT基因家族成员进行鉴定、表达分析和克隆。【结果】获得5个BCAT基因家族成员,分别命名为CcBCAT1、CcBCAT2、CcBCAT3、CcBCAT4和CcBCAT5,随后对其进行生物信息学分析并克隆CcBCAT1～CcBCAT4。生物信息学分析显示,这些基因分布于辣椒的4条染色体上,蛋白均为亲水性蛋白,氨基酸长度在184～557 aa,分子量为20.29～89.60 ku,等电点为5.57～8.34。亚细胞定位预测结果显示,CcBCAT1定位于叶绿体和线粒体,其他基因家族成员均位于叶绿体。CcBCATs基因时空表达分析显示,CcBCAT1-4基因具有组织表达特异性,Cc...