盐胁迫下匍匐翦股颖抗氧化酶活性及基因表达机制研究

为研究匍匐翦股颖在盐胁迫下抗氧化酶活性与基因表达的影响机制,模拟盐胁迫条件,用0 mol/L(CK),0.2 mol/L的NaCl溶液对两种不同耐盐性的匍匐翦股颖Penncross和SeasideⅡ进行处理,测定了超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT),抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化物酶(POD)活性;用同源克隆的方法克隆了匍匐翦股颖CytSOD,FeSOD,CAT,APX,POD的部分片段,并设计了5个基因的qRT-PC引物,对5个抗氧化酶基因表达量进行了荧光实时定量测定,分析了两种不同耐盐性的匍匐翦股颖在盐胁迫条件下,抗氧化酶活性与基因表达的变化规律。结果表明,盐胁迫对两种不同耐盐性的匍匐翦股颖抗氧化酶活性和基因表达的影响不同,在盐胁迫初期,盐敏感的Penncross SOD活性比耐盐的SeasideⅡ高,盐处理中、后期Penncross SOD活性快速下降,SeasideⅡSOD活性下降慢而且能保持相对稳定,在这一阶段SeasideⅡSOD活性显著高于Penncross;CAT,APX和POD活性随着盐处理的延长,酶活性增加,Penncross CAT和APX活性低于SeasideⅡ,POD活性两者差异不大。盐胁迫下,Penncross CytCu/ZnSOD,CAT、APX 和POD表达量上调,而FeSOD下调;SeasideⅡ5种抗氧化酶基因表达量上调,CytCu/ZnSOD,FeSOD,CAT和APX的表达量显著高于Penncross,而POD表达量差异不大。两种匍匐翦股颖CytCu/ZnSOD、CAT、APX和POD表达量变化与酶的活性变化较一致,而盐敏感的FeSOD的表达量变化与SOD活性变化不一致。     

藏羊MSTN基因克隆、生物信息学及组织表达分析

【目的】对藏羊肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN)基因进行克隆和生物信息学分析,检测其在藏羊不同组织中的表达,为探究MSTN基因在藏羊中的生物学功能提供参考。【方法】以藏羊背最长肌组织cDNA为模板,克隆藏羊MSTN基因完整CDS区序列并测序,用SeqMan程序对测序结果进行拼接,并用BLAST在线程序对组装后的序列进行分析鉴定。用生物信息学软件进行相似性比对、系统进化树构建及生物信息学分析,用实时荧光定量PCR检测MSTN基因在藏羊不同组织中的表达量。【结果】藏羊MSTN基因CDS全长为1 128 bp,编码375个氨基酸。藏羊MSTN基因氨基酸序列与绵羊、牦牛、牛、猪、恒河猴、人、黑猩猩、犬、鸡及斑马的相似性依次为100.0%、93.4%、93.4%、95.2%、94.4%、94.2%、94.4%、93.1%、87.8%和87.5%;系统进化树分析结果表明,藏羊与绵羊的亲缘关系最近,与斑马和鸡的亲缘关系最远。藏羊MSTN蛋白属于亲水性分泌蛋白,且具有不稳定性,不含跨膜结构,含1个信号肽,存在31个潜在的磷酸化位点、2个N-糖基化修饰位点,主要分布在线粒体和细胞质中;MS...     

猪α-干扰素表达系统及其应用的研究进展

就猪α-干扰素的分子特征、生物学特性、表达系统和猪基因工程α-干扰素的应用进行综述,以期为猪α-干扰素在广谱抗病毒活性、抗肿瘤以及免疫调节的临床应用提供参考。     

猪BPI蛋白重组载体的构建及真核表达

试验旨在构建猪BPI真核表达载体,获得猪源BPI重组蛋白.根据GenScript's CloneEZ^® PCR Cloning Kit试剂盒,将BPI编码序列克隆至pUC57载体上,酶切与测序鉴定无误后,将重组质粒pUC57-BPI转染293-6E细胞,并利用SDS-PAGE和Western blotting方法检测其表达水平.结果显示,本试验成功构建了猪源BPI蛋白真核表达载体pUC57-BPI,并在293-6E细胞培养上清中检测到猪源BPI重组蛋白的表达.该猪源BPI重组蛋白体外表达系统的建立为今后深入研究猪BPI的生物学功能以及猪抗菌蛋白的制备提供了试验基础.     

大肠杆菌K_(88ac)与LT(A~-B~ )抗原基因质粒在猪霍乱沙门氏菌弱毒株中的表达

应用细菌质粒转化技术,将大肠杆菌K_(?)与LT(A~-B~ )抗原基因重组质粒转入猪霍乱沙门氏菌弱毒菌苗株中.对获得的其中8个转化子进行鉴定的结果表明,转化的细菌仍保持沙门氏菌的形态、生化及抗原特性,同时可稳定地表达K(?)和LT-B两种抗原.用微量间接血凝试验、抗甘露糖豚鼠红细胞凝集试验(MRHA)、ELISA等对转化菌表达的K(?)抗原进行了测定,用间接免疫溶血试验对其表达的LT-B抗原进行了测定.结果,这两种抗原在转化的细菌中均可高效表达.电镜下观察,转化的细菌在其表面形成菌毛样结构.这种转化细菌表现出猪霍乱沙门氏菌与产肠毒素性大肠杆菌的两种抗原特性,为这种双价工程菌苗的研制提供了有价值的候选菌株.本研究结果还表明,猪霍乱沙门氏菌弱毒菌苗株可作为基因转化的有效受体菌.     

雏鸡冷应激前后血清中差异蛋白质组学研究

本试验旨在比较分析雏鸡冷应激前后血清中蛋白质的表达差异,并对重点差异蛋白质进行鉴定。将30只雏鸡随机分为3组,分别为冷应激组、冷适应组和常温对照组,收集各组雏鸡的血液制备血清后进行双向凝胶电泳(2-DE),以获得血清蛋白质表达的2-DE图谱,对2-DE图谱进行差异分析(利用PDQuest 8.0软件),随后采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对差异表达蛋白质进行鉴定,并利用蛋白质印迹(Western blot)方法进行验证。结果显示:通过2-DE对常温对照组、冷应激组和冷适应组雏鸡血清进行分析,得到了比较完整的差异蛋白质数据,共找到差异蛋白质点23个。采用MALDI-TOF-MS技术分析其中几个重复性好且较为明显的蛋白质点,成功鉴定出4个差异蛋白质,其中2个为果糖二磷酸醛缩酶C(ALDOC),是参与葡萄糖、能量代谢通路供能的相关蛋白;随后,对差异蛋白质ALDOC进行Western blot验证,所得结果与2-DE的结果相一致。结果表明,雏鸡冷应激前后血清中蛋白质的表达具有明显的差异,这些蛋白质的表达差异可能与冷应激有关。     

伽氏疏螺旋体尚志株P66基因的原核表达与鉴定

为获得伽氏疏螺旋体尚志株（B. garinii SZ）的P66蛋白,本研究从培养的螺旋体菌液中提取总RNA,反转录合成第一链cDNA,利用PCR扩增P66基因。将目的片段连接表达载体pET-30a（+）,并转化大肠杆菌表达菌BL21（DE3）,经PCR、双酶切及测序验证正确后,进行IPTG诱导表达和纯化,然后将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。SDS-PAGE结果显示,获得约70 ku的表达产物;Western blotting分析表明,表达产物与抗His标签的小鼠单克隆抗体、螺旋体鼠源阳性血清、兔抗P66多克隆抗体均能发生反应,获得的多克隆抗体也可识别天然蛋白。本试验成功表达了B. garinii SZ株P66蛋白,并制备了多克隆抗体,为后续B. garinii SZ株P66蛋白的功能研究奠定了基础。     

苜蓿皂苷对大鼠肝脏及肝脏细胞低密度脂蛋白受体、三磷酸腺苷结合盒转运体mRNA表达的影响

本试验旨在研究苜蓿皂苷对大鼠肝脏及大鼠肝脏细胞(BRL细胞)胆固醇清除和转运途径中关键基因低密度脂蛋白受体(LDLR)、三磷酸腺苷结合盒转运体G5(ABCG5)、三磷酸腺苷结合盒转运体G8(ABCG8)mRNA表达量的影响,从个体和细胞水平初步探讨苜蓿皂苷调控胆固醇清除和转运的分子机制。采用高脂饲粮建立大鼠高脂模型,测定苜蓿皂苷对正常、高脂大鼠血清指标[总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量]和肝脏LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA表达量的影响;采用高糖DMEM培养液建立BRL细胞脂变模型,测定苜蓿皂苷浓度对BRL细胞活性的影响,测定苜蓿皂苷对正常、脂变细胞LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA表达量的影响。结果表明:1)苜蓿皂苷显著降低高脂大鼠血清中TG、TC和LDL-C的含量(P0.05);2)苜蓿皂苷显著上调正常大鼠肝脏LDLR、ABCG5、ABCG8及高脂大鼠ABCG5、ABCG8 mRNA表达量(P0.05);3)添加200、250μg/m L苜蓿皂苷显著提高了BRL细胞的活性(P0.05);4)苜蓿皂苷显著上调正常BRL细胞LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA表达量(P0.05),而对脂变BRL细胞各基因mRNA表达量无显著影响(P0.05)。结果提示,苜蓿皂苷可通过调控LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA的表达来增加肝细胞内胆固醇的清除和转运,从而降低机体胆固醇的含量。     

鸡白细胞介素2原核表达载体的构建及表达产物的鉴定

将鸡白细胞介素2(IL-2)的cDNA克隆到原核表达载体pET-30a( )上，构建原核重组表达质粒pET-IL-2，并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，37℃用IPTG诱导3.5h后，SDS-PAGE检测表明，表达蛋白以包涵体的形式存在。将诱导后的工程菌超声波裂解，离心后的沉淀用PBS洗涤5～6次，得到高纯度的目的蛋白。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒（AIV）A／Goose／HLJ／p46／2003（H5N1）的NSl基因，将其克隆于融合蛋白表达载体pMAL-c2X上，转化DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定及序列分析，表明筛选到了重组质粒pc2X-NS1。SDS-PAGE电泳结果显示，重组质粒转化TB1大肠埃希氏菌后，经0．3mmol／L的IPTG诱导，融合蛋白MBP-NS1得到大量表达，融合蛋白以可溶形式存在，分子质量约为67ku。Western-blotting检测结果表明，融合蛋白MBP-NS1能够与H5N1亚型AIV活病毒感染康复鸭血清发生特异性反应，而不能够与H5N1亚型AIV灭活疫苗免疫鸭血清发生反应。试验初步建立了以纯化的融合蛋白MBP-NS1为包被抗原的间接ELISA检测方法，为AIV灭活疫苗免疫家禽与AIV感染家禽的鉴别诊断奠定了基础。