拟南芥AtWNK9基因的定位及表达分析

AtWNK9为拟南芥WNK（With no lysine kinase）激酶家族成员，其功能尚不清楚.采用生物信息学和生物学实验相结合的方法，对AtWNK9蛋白结构、亚细胞定位、启动子元件、基因表达模式进行了分析.研究发现，AtWNK9定位在细胞核中；该基因在拟南芥根中高效表达，其表达受ABA，NaCl、葡萄糖、热和冷等非生物胁迫处理强烈诱导.结果表明，AtWNK9为非生物胁迫反应相关基因，并可能参与根的生长发育.     

绵羊Musclin基因真核表达载体的构建及其对肌细胞糖代谢和胰岛素作用的影响

为了研究绵羊Musclin对糖代谢和胰岛素作用的影响,本试验运用生物信息学软件对其结构特征进行预测,并构建绵羊Musclin基因真核表达载体。分4组对绵羊胎儿成肌细胞进行处理：空载体组（pcDNA3.1）、Musclin过表达组（pcDNA3.1-Musclin）、空载体+胰岛素组（pcDNA3.1+Insulin）、Musclin过表达+胰岛素组（pcDNA3.1-Musclin+Insulin）。然后分别在分化48和72 h时收集细胞,检测Musclin对正常或添加胰岛素培养的分化状态绵羊肌细胞糖代谢的影响,并利用荧光定量PCR检测相关基因表达的变化。酶切鉴定和测序结果表明,成功构建了表达载体pcDNA3.1-Musclin。生物信息学分析表明,绵羊Musclin蛋白含有一个信号肽,并在28氨基酸位点处存在一个酶切位点。亚细胞定位在胞外,属于分泌蛋白。其二级和三级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。细胞试验表明,绵羊Musclin基因过表达明显减少了正常或胰岛素处理的绵羊肌细胞糖原含量并增加了培养液中葡萄糖含量。诱导分化72 h时,过表达Musclin抑制了Musclin过表达组和Musclin过表达+胰岛素组绵羊肌细胞中IRS1、AKT1、AKT2、GLUT1、GLUT4基因mRNA表达,并促进了GSK3β mRNA表达;而诱导分化48 h时,只有GLUT4基因的表达受到抑制。综上所述,绵羊Musclin基因过表达可以影响肌细胞糖代谢并减弱胰岛素的作用,二者相互协调以维持糖代谢稳态。其作用机制涉及到上述相关基因的表达变化,且与绵羊成肌细胞的分化状态有关。     

牦牛StAR基因克隆及其生物信息学与组织表达特性的研究

旨在克隆获得牦牛StAR基因编码序列（CDS）并进行生物信息学分析,探究其mRNA组织表达特性。本研究以屠宰场采集的成年母牦牛心、肝、脾、肺、肾、卵巢、输卵管、子宫组织（n=5）,不同年龄（胎牛、1岁、2岁）牦牛的卵巢（n=3）,不同发情周期（卵泡期、黄体期）的牦牛卵巢（n=3）,黄体期黄牛的卵巢（n=3）及实验室冻存的牦牛颗粒细胞为研究材料。以牦牛黄体期卵巢cDNA为模板,用逆转录PCR克隆StAR基因,并使用MEGA7.0和ExPASy-ProtParam等软件分析其生物信息学特性;采用实时荧光定量PCR技术分析牦牛StAR基因组织表达特性。结果发现,StAR基因CDS区长858 bp,编码285个氨基酸,StAR蛋白总体带正电荷,属于碱性亲水稳定蛋白,无跨膜结构及信号肽,主要存在于细胞质和线粒体; StAR基因具有较高的保守性,符合物种进化规律。牦牛StAR基因在卵巢表达水平最高（P<0.01）,且2岁时卵巢表达水平极显著高于胎牛和1岁龄（P<0.01）,黄体期卵巢表达水平极显著高于卵泡期（P<0.01）;黄体期黄牛卵巢中StAR基因的表达量极显著高于牦牛（P<0.01）;在颗粒细胞的体外培养过程中StAR基因表达量逐渐上升,在培养24 h时达到高峰（P<0.01）,随后显著降低。综上所述,StAR基因序列较为保守,在牦牛卵巢组织中表达最高,且表达水平随年龄与卵巢周期而变化,提示StAR基因可能参与牦牛卵巢及黄体功能相关的繁殖调控。     

犏牛和牦牛ESCO2基因的序列特征及其在睾丸中的表达对比分析

旨在克隆犏牛和牦牛姐妹染色单体内聚建立蛋白2（establishment of sister chromatid cohesion N-acetyltransferase 2,ESCO2）基因,并分析其在不同发育阶段睾丸中的表达与定位,为进一步解析ESCO2在减数分裂过程中的作用机制提供理论依据。本研究以健康雄性犏牛及牦牛为试验动物,根据年龄分为胎牛组（5~6月龄）、幼年组（1~2岁）和成年组（3~4岁）,每组各3头。通过RT-PCR技术克隆犏牛和牦牛ESCO2基因并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测ESCO2基因在犏牛不同组织中的表达谱,比较分析ESCO2在犏牛和牦牛不同时期睾丸中的表达规律,利用免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）技术检测ESCO2蛋白的细胞定位和表达差异。结果显示,犏牛ESCO2基因（GenBank登录号：MW198470） CDS区为1 833 bp,编码610个氨基酸,与牦牛相比,犏牛ESCO2序列第301~319位多19个氨基酸,另有3个氨基酸突变;犏牛ESCO2蛋白序列与黄牛的同源性高于其他哺乳动物;ESCO2可能与SMC3、SMC1A、PDS5A、PDS5B、STAG2等蛋白相互作用,互作蛋白功能与姐妹染色单体凝聚、减数分裂细胞周期、DNA修复、细胞分裂和染色体重构等生物学过程相关。ESCO2在犏牛各组织中均有表达,但在睾丸中的相对表达水平显著高于其它组织（P<0.05）;在犏牛睾丸中的表达随年龄增长呈上升趋势,幼年和成年时期犏牛睾丸中ESCO2的表达显著低于同时期牦牛（P<0.05）;IHC染色结果发现,雄性犏牛减数分裂阻滞于初级精母细胞,ESCO2蛋白在犏牛初级精母细胞中无表达并与牦牛存在差异。本研究结果表明,犏牛与牦牛的ESCO2基因、蛋白序列差异较大,且在睾丸发育过程中的表达模式差异显著,这可能是引起雄性犏牛减数分裂阻滞及不育的原因之一,其具体作用机制有待进一步研究。     

猪ADAR2基因全长cDNA克隆、序列特征及表达模式分析

旨在克隆猪作用于RNA的腺苷脱氨酶2基因（ADAR2）全长cDNA序列,同时对该基因在猪不同组织中的表达规律进行探索。利用RACE （rapid-amplification of cDNA ends）对大白猪ADAR2基因mRNA全长序列进行克隆,并进行生物信息学分析;用荧光定量PCR方法检测35日龄大白猪心、肝、肺、肾、脾、脑、小肠、背最长肌和背部脂肪9种组织中ADAR2的表达水平。结果表明,猪ADAR2基因cDNA全长6 305 bp,共包含12个外显子,编码704个氨基酸,与人、黑猩猩、猕猴、长臂猿、黄牛、山羊和绵羊的CDS区核酸序列和氨基酸序列的一致性均在84%以上。该基因编码的蛋白含有2个双链RNA结合基序和一个脱氨酶结构域。猪ADAR2在检测的各组织中均表达,其中在肺中的表达量最高。综上所述,本研究成功克隆了猪ADAR2基因全长cDNA序列,并且发现其在猪体内广泛表达,为深入研究ADAR2的功能奠定了良好的基础。     

Production of monoclonal antibody against recombinant bovine sex-determining region Y (SRY) and their preferential binding to Y chromosome-bearing sperm

Separation of X and Y chromosome-bearing sperm is an appropriate method for the selection of desired sex of offspring to increase the profit in livestock industries. The purpose of this study was the production of a monoclonal antibody against recombinant bovine sex-determining region Y protein for separation Y sperm. The hybridoma cells from splenocytes of immunized female's balb/C mice and Sp2/0 cells were made. The binding affinity of our monoclonal antibody (mAbSRY2) was compared with mouse monoclonal SRY-15. The Western blot method indicated that mAbSRY2 successfully detected the rbSRY protein. The specificity and sensitivity of mAbSRY2 is comparable to SRY-15 commercially ones. The SRY gene in 100% of bull semen contains the Y chromosome that had the strongest binding affinity to mAbSRY2 was synthesized. In other words, the binding affinity of semen contains the X sperms near the negative control. In general, this immunological method can help to separate X from Y sperms. However, the mAbSRY2 is bind to Y-bearing sexed sperm, but in the future; the sexed sperms need to apply in farms.     

Developmental competence of heat stressed oocytes from Holstein and Limousine cows matured in vitro

The negative effects of heat stress on dairy cattle's fertility have been extensively studied, but the relevant knowledge for beef cattle is rather limited. The aims of this study were to investigate the effects of HS during in vitro maturation on the developmental potential of oocytes derived from Limousine and Holstein cows and to estimate the effect of the differential gene expression of important genes in oocytes, cumulus cells and blastocysts in the growth competence between the breeds. In seven replicates, cumulus oocyte complexes from Holstein and Limousine cows were matured for 24 hr at 39°C (controls C; Hol_39, Lim_39) or at 41°C from hour 2 to hour 8 of IVM (treated T; Hol_41, Lim_41), fertilized, and presumptive zygotes were cultured for 9 days at 39°C. Cleavage and embryo formation rates were evaluated 48 hr post-insemination and on days 7, 8 and 9, respectively. From all groups, subsets of cumulus cells, oocytes and blastocysts were analysed for the relative expression of genes related to metabolism, stress, apoptosis and placentation. No difference was detected in cleavage rate or in blastocyst formation rate among the control groups. In both breeds, heat stress reduced blastocyst yield, but at all days the suppression was higher in Limousines. In Holsteins, altered gene expression was detected in cumulus cells (G6PD, GLUT1) and blastocysts (PLAC8), while in Limousines, differences were found in oocytes (G6PD, HSP90AA1), in cumulus cells (CPT1B, HSP90AA1, SOD2) and blastocysts (DNMT, HSP90AA1, SOD2). It appears that Holstein COCs are more tolerant than Limousine COCs, possibly due to compulsory, production driven selection.     

口蹄疫病毒VP1基因密码子偏好性分析

VP1蛋白是口蹄疫病毒(FMDV)的主要结构蛋白,可诱导机体产生中和抗体以及激发保护性免疫应答。为探究VP1基因密码子偏好性,筛选出其最佳体外表达系统,使用Visual Gene Developer、CodonW、GraphPad Prism等软件,对VP1基因进行密码子偏好性分析,同时将VP1基因密码子使用频率与大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统作了比较。结果显示,VP1基因的CAI为0.21,ENC为55.43,GC3S为65.26%,表明该基因密码子使用偏好较弱并且密码子偏好以G/C碱基结尾。结合VP1基因与各表达系统密码子使用频率比值,发现其与昆虫杆状病毒表达系统频率比值差异最小且CAI最大,因此推断昆虫杆状病毒表达系统是FMDV VP1基因最适体外表达系统。本研究为FMDV亚单位疫苗研制等提供了技术基础。     

鸡FKBP5基因的克隆、生物信息学及组织表达谱分析

本研究旨在对鸡FK506结合蛋白5(FK506 binding protein 5,FKBP5)基因进行克隆和生物信息学分析,并检测其在鸡不同组织中的表达量。以鸡脾脏cDNA为模板,通过PCR方法扩增和克隆鸡FKBP5基因完整CDS区序列,并进行同源性比对及系统进化树构建;使用在线软件分析FKBP5蛋白的理化性质、疏水性、跨膜结构、信号肽、二级结构和三级结构;利用实时荧光定量PCR检测其在肢体内外翻畸形(valgus-varus deformity,VVD)组肉鸡和正常组肉鸡组织中的表达量,并绘制组织表达谱。结果显示,鸡FKBP5基因CDS区序列全长1350 bp,编码449个氨基酸;同源性比对和进化树分析表明,鸡FKBP5基因氨基酸序列与鹌鹑、鸭、壁虎、中华鳖、小鼠、人、猪、斑马鱼的同源性分别为98.4%、96.2%、85.8%、87.4%、81.1%、85.2%、86.1%和61.2%,与鹌鹑、鸭的亲缘关系最近,爬行类和哺乳类动物次之,与斑马鱼(鱼类)亲缘关系最远。鸡FKBP5蛋白分子质量为50.43 ku,理论等电点(pI)为5.94,半衰期为30 h,肽链N端为蛋氨酸(Met),不稳定系数为23.80,属于稳定蛋白;跨膜区和信号肽预测结果显示,FKBP5蛋白不属于跨膜蛋白和分泌型蛋白。结构域分析结果表明,该蛋白包括2个FKBP型肽基脯氨酰异构酶(FKBP-type peptidylprolyl isomerases)、3个四肽重复(TPR)序列,主要包含α-螺旋(46.77%)、延伸链(12.47%)和无规则卷曲(40.76%),且该蛋白与HSPA2、PPID、STIP1、HSP90AA1和HSP90AB1等互作蛋白具有很强的相关性。实时荧光定量PCR结果显示,FKBP5基因在鸡各组织中广泛表达,其中在软骨和法氏囊中表达量较高,在发病组肉鸡组织中的表达量均高于正常组肉鸡,且在心脏、腿肌、法氏囊、胸腺、软骨中表达量差异显著(P<0.05),在脾脏中表达量差异极显著(P<0.01)。本试验结果可为肉鸡骨骼疾病及腿部健康选育提供参考。