犬瘟热病毒疫苗株附着蛋白基因的克隆及同源性比较

根据发表的犬瘟热病毒(CDV)参考株Ondetstepoort的序列设计1对引物,以犬瘟热病毒疫苗株感染Vero细胞总RNA为模板,利用RT-PCR扩增出附着蛋白基因843 bp片段,将这个片段连接到pMD18-T载体上,经过PCR鉴定、酶切鉴定得到1个阳性克隆,将阳性质粒进行序列测定,结果表明,该片段与Onderstepoort株核苷酸同源性为95.9%。从基因角度为犬瘟热的预防、诊断和治疗提供理论依据。     

鹅细小病毒四平分离株VP3基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅细小病毒(GPV)核苷酸序列,设计并合成了1对引物,对吉林农业大学预防兽医学研究室分离鉴定的GPV四平株(SP)主要保护性抗原蛋白VP3基因进行扩增。所得到的PCR产物片段大小约1.6 kb,与预期片段大小相符。将该片段纯化后与T载体连接,转化到感受态大肠杆菌JM-109中进行克隆。对所提质粒进行快速鉴定、PCR鉴定以及限制性内切酶NheⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒,对重组质粒测序并进行核苷酸序列分析。结果表明:GPV四平株VP3基因长1 605 nt,包含了完整编码GPV VP3蛋白阅读框,且与国内GPV分离株B,GD,HG5/82相应核苷酸序列和氨基酸序列的同源性较高,分别为96.2%,96.3%,96.4%和97.4%,98.7%,98.9%。据此认为,GPV四平株VP3基因可以作为构建具有普遍应用价值的基因工程疫苗的候选基因。     

山羊卵泡发育相关基因的筛选及分析

【背景】山羊第一卵泡波中的优势卵泡（dominant follicles, DF）和从属卵泡（subordinate follicles, SF）是整个卵泡发育过程中最为关键的两个阶段。随着卵泡的进一步发育,最终DF可能发育成为成熟卵泡,直到排卵;SF将走向闭锁,其中颗粒细胞的凋亡是导致卵泡发生闭锁的关键因素。然而目前对促进卵泡的优势化或导致其闭锁的分子机理尚不清楚。【目的】通过对山羊第一卵泡波中DF和SF颗粒细胞进行高通量测序,旨在筛选影响卵泡发育的关键基因,为深入探究卵泡发育的调控机制提供理论依据。【方法】选取10只1岁龄健康的贵州白山羊分别注射前列腺素F_2α,使其同期发情,此后每天用B超检测并记录卵泡的生长情况,发情3 d后,统一屠宰并采集第一卵泡波中DF (直径4.5—6 mm)与SF (直径3 —4.5 mm),分别分离其中的颗粒细胞,提取总RNA、构建文库后通过Illumina Hiseq 2500平台进行测序。利用FastQC对测序产出raw reads进行质量评估并经过过滤后,获得品质较高的clean reads;使用Trinity对得到的clean reads进行重新组装,从而获得unigenes;使用CLC Genomics Workbench将unigenes与山羊RefSeq数据库进行比对获得mRNA;使用DESeq2 软件对获得的mRNA进行差异表达分析;分别采用goseq和kobas软件对得到的差异表达基因进行GO分析及KEGG信号通路分析;最终通过qRT-PCR对筛选出的可能影响卵泡发育的关键基因进行验证。【结果】分别对测序得到的raw reads进行过滤后,在DF颗粒细胞中获得43 217 934条clean reads,占raw reads的比例为95.19%;SF颗粒细胞中获得40 766 348条clean reads,占raw reads的比例为95.35%。将得到的unigenes与山羊的RefSeq 数据库进行比对后,共得到33 896条带有注释的转录本,再通过设定FPKM>1, q value<0.05,共在两种卵泡颗粒细胞中获得13 644个基因。设定参数：FPKM≥1,SF-FPKM/DF-FPKM>1,P<0.05,获得695个差异表达mRNA,其中233个在SF颗粒细胞中表达显著上调,462个表达显著下调;对所获得695个差异表达mRNA进行GO功能富集分析,共分为三大类42组：其中生物学过程占47.6%,细胞组分占47.6%,分子功能占4.8%;KEGG信号通路分析,发现20条通路,其中与核糖体通路相关的基因富集最为显著。通过在Genecard中进行功能分析后,筛选6个可能与山羊卵泡发育密切相关的基因,其中PRLR、PTX3、RGN在SF颗粒细胞中表现为上调;DKK3、ALDH1A2、RARRES1则表现为下调。qRT-PCR显示PRLR、RGN、DKK3、ALDH1A2、RARRES1的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在从属卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于优势卵泡（P<0.01）;DKK3、ALDH1A2、RARRES1在优势卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于从属卵泡（P<0.01）。【结论】DKK3、ALDH1A2、RARRES1和RGN在优势卵泡和从属卵泡中表达量存在极显著差异,推测在山羊卵泡发育过程中可能促进卵泡的优势化或导致闭锁,对深入探究卵泡发育的调控机制具有重要意义。     

基于高通量测序的露地菊(Chysanthemum×grandiflora)盐胁迫转录组分析

为揭示露地菊生长发育及耐盐胁迫的应答机制和分子基础,本研究以盐胁迫处理的露地菊及其对照为材料,使用Illumina Hiseq2500高通量测序平台对转录组进行测序,分别获得了60370448和71415448条Clean reads,通过序列拼接组装得到45591条Unigene,平均长度724 bp。有37675条Unigene在七大数据库(COG,GO,KEGG,KOG,Pfam,Swiss-Prot,NR)中得到注释。通过比对露地菊盐胁迫处理组和对照组样品间Unigene的表达量及在各数据库中的注释情况,统计得到:有4143条差异表达基因获得注释;有2441条差异表达基因在GO数据库中获得功能注释;注释到COG数据库中的2281条差异表达基因依据功能可分为25类;有1062条差异基因映射到KEGGPathway数据库中,涉及了199个代谢通路,包括核糖体途径、植物激素信号传导途径、淀粉蔗糖代谢、碳代谢、氨基酸的生物合成等。本研究获得的转录组数据将有助于揭示露地菊生长发育及耐盐胁迫的应答机制和分子基础,及相关抗性基因的挖掘和分子辅助育种等方面的研究。     

辽河干流河岸带植物及微生物多样性研究

为明确辽河保护区河岸带生物多样性恢复现状以促进河岸带生态系统的健康管理,本研究通过植被现场调查和土壤微生物高通量测序分析,对辽河干流23个采样点的植物多样性和微生物多样性进行测定,结果表明:辽河干流23个采样点的植被Shannon-Weiner多样性指数平均为1.227,平均植被覆盖率达到74.19%;河岸带土壤微生物Shannon-Weiner多样性指数平均为9.55;其优势度大于1%的细菌属于11个门、32个纲、40个属;人类活动干扰、放牧情况以及土地利用类型是影响河岸带植物和微生物多样性的关键因子。目前辽河保护区河岸带生物多样性恢复状态较好,但日渐增多的人类活动对河岸带生物多样性的恢复产生不利影响,因此建议尽量减少封育区内的人类活动、放牧情况等,以加快辽河保护区河岸带植物及土壤微生物多样性的恢复进程。     

添加芽孢杆菌对草鱼池塘中真核微生物的影响

为了研究添加芽孢杆菌对池塘中真核微生物群落结构和理化因子的影响,采用高通量测序技术分析了实验组(添加芽孢杆菌池塘)与对照组(普通池塘)水体真核微生物群落结构,同时分析了两组池塘的水体理化指标。结果表明:8、9月实验组池塘水体中TN、NH_4~+-N、NO_3~--N含量显著低于对照组(P0.05)。水体中梅尼小环藻(Cyclotella meneghiniana)、红囊藻(Hedriocystis)、蓝隐藻(Chroomonas)、丝孢酵母属(Trichosporon)和小环藻属(Cyclotella)真核微生物丰度显著高于对照组(P0.05)。实验组池塘水体真核微生物Chao1指数和Shannon指数显著高于对照组(P0.05)。实验结果证实:通过向池塘添加芽孢杆菌,可以改变水体中真核微生物群落的结构,从而实现对池塘理化因子的调节。研究结果对于降低水产养殖尾水对水域环境的污染具有一定的意义。     

基于高通量测序技术分析2种菌草根际土壤真菌群落多样性

为了解福州菌草基地巨菌草和绿洲一号2种菌草的根际土壤真菌群落多样性,采用Illumina Miseq高通量测序技术和生物信息学方法,对菌草根际土真菌的多样性及群落结构进行分析。结果表明：从3份土壤样本中获得525 292条ITS序列,在97%序列相似性基础上可划分为7267个可操作分类单元（OTU）。真菌群落的丰富度指数（ACE）以菌草非根际土最低,绿洲一号根际土略高于巨菌草根际土;而多样性指数（Shannon-Wiener和Simpson）菌草根际土高于非根际土,绿洲一号根际土略高于巨菌草根际土。3份样品的优势菌门为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、接合菌门（Zygomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）、球囊菌门（Glomeromycota）;优势菌纲为散囊菌纲（Eurotiomycetes）、粪壳菌纲（ Sordariomycetes）、座囊菌纲（Dothideomycetes）、伞菌纲（Agaricomycetes）、锤舌菌纲（Leotiomycetes）、圆盘菌纲（Orbiliomycetes）、银耳纲（Tremellomycetes）、粘膜菌纲（Wallemiomycetes）;优势菌属为篮状菌属（Talaromyces）、深黄伞形霉属（Umbelopsis）、枝孢菌属（Cladosporium）、暗双孢菌属（Cordana）、镰刀菌属（Fusarium）、隐球菌属（Cryptococcus）、淡紫紫霉属（Purpureocillium）、赤霉菌属 （Gibberella）、灵芝属（Ganoderma）。研究结果表明,菌草根际土真菌群落多样性高于非根际土,为进一步更好地利用菌草提供理论参考依据。     

间作木薯对橡胶树根际土壤真菌群落结构的影响

研究间作木薯对橡胶树根际土壤真菌群落多样性变化规律,为判断胶园间作木薯的可行性提供理论支撑。以橡胶与木薯间作为处理,橡胶单作为对照,采用传统方法和高通量测序技术分析橡胶树根际土壤理化性状及真菌群落结构。结果表明：（1）间作模式下橡胶树根际土壤的碱解氮、速效磷、速效钾、有机质含量和真菌Shannon指数显著降低,真菌Simpson指数显著提高,pH和Chao1指数虽有降低,但差异未达到显著水平;（2）门分类水平上,2个处理的橡胶树根际土壤真菌群落结构组成相近,共有的3大优势菌门均为Ascomycota、Zygomycota和Basidiomycota。间作木薯降低了橡胶树根际土壤中Zygomycota和Basidiomycota的相对丰度,但提高了Ascomycota相对丰度,达到91.54%;（3）属分类水平上,2个处理中相对丰度比例前10的优势菌属占所有检测出菌属的61.30%~65.59%,间作木薯提高了橡胶根际土壤中Phyllosticta、Gibberella和Lecythophora的相对丰度;（4）土壤碱解N、速效P和速效K含量对橡胶树根际土壤中真菌群落α-多样性产生影响,土壤真菌多样性变化与土壤有机质含量有关。因此,间作木薯增加了植物对土壤矿质营养元素的吸收,导致橡胶树根际土壤肥力下降,进一步降低了橡胶树根际土壤真菌的群落多样性,同时增加了病原真菌的丰度。     

磁处理改善豌豆根际土壤生物学性状

采用盆栽的方法,分析磁处理对豌豆根际土壤生物学性状的影响,旨在探究磁处理对豌豆根际土壤肥力及健康状况的影响。试验设置无处理（对照CK）,添加铁粉（A）、磁化铁粉（B）、场强为0.2特斯拉（T）磁铁+铁粉（C）以及0.2 T磁铁（D）的处理,基于高通量测序技术分析磁处理对豌豆根际土壤生物学性状的影响。结果表明：C处理显著增加豌豆根际土壤中可培养细菌和真菌数量,同时微生物生物量C、N、P与CK相比分别增加了34.0%、46.0%、44.2%;β-葡萄糖苷酶、氨肽酶、磷酸酶酶活性分别增加了24.6%、23.7%、31.8%;另一方面,C处理中土壤细菌丰富度和多样性指数Ace、Chao1、Shannon指数显著高于CK;属（Genus）分类水平韦恩图分析中上,CK处理特有的属细菌主要有3个：Sneathiella、Desulfurispora、nannocystaceae;A处理特有的属细菌有7个;B处理特有的属细菌亦有7个;C处理特有的属细菌有11个;D处理特有的属细菌有8个。综上所述,C处理能够显著提高豌豆根际土壤中可培养微生物数量、微生物生物量（C、N、P）、酶活性和细菌多样性等多项指示土壤肥力和健康状况的生物学指标,表明磁场强度为0.2 T的磁铁+5 g磁化铁粉处理具有提高土壤肥力抵御土传病害的能力。     

Effects of different molecular weights of chitosan on methane production and bacterial community structure in vitro

As a new feed additive, chitosan has been shown in recent years to have a certain role in reducing methane emissions from the gastrointestinal tracts of ruminants. However, the effects of chitosan with different molecular weights on rumen fermentation, methane production and bacterial community structure are not yet clear. A basal diet without chitosan served as the control(CTL), and the treatment diets were supplemented with chitosan with different molecular weights: 1 000(1K), 3 000(3K), 5 000(5K), 50 000(5W) and 200 000(20W) dry matter(DM). Six fermentation units per treatment were established. Gas chromatography was used to measure the concentrations of methane, H_2 and volatile fatty acids(VFAs). The bacterial 16S rRNA genes were sequenced with an Illumina MiSeq platform and analysed to reveal the relative abundances of bacterial community taxa. The results showed that the propionate proportion was significantly increased by the addition of chitosan with different molecular weights(P0.05), while methane production and the acetate proportion were significantly decreased(P0.05). The relative abundances of Rikenellaceae_RC9_gut_group and Prevotellaceae_UCG_003 were significantly increased in the 3K chitosan group compared with the CTL group, whereas the relative abundance of Ruminococcaceae_NK4A214_group was significantly decreased(P0.05). Correlation analyses of the relative abundances of the bacterial genera showed that Prevotella was positively related to propionate production(P0.05). In conclusion, 3K chitosan could reduce methane production by replacing fibrolytic bacteria(Firmicutes and Fibrobacteres) with amylolytic bacteria(Bacteroidetes and Proteobacteria) in the bacterial community structure.