日本乙型脑炎病毒E抗原表位的筛选

为筛选日本乙型脑炎病毒(JEV)的E抗原表位,本实验以抗JEV E蛋白的单克隆抗体(MAb)作为固相筛选分子,应用噬菌体表面展示技术,按消减、结合、洗脱、扩增的顺序筛选噬菌体七肽库,挑取噬菌体单克隆培养并采用MAb包被的ELISA鉴定,对阳性克隆测序分析,确定JEV E抗原模拟表位的氨基酸序列.设计合成包含该表位的E抗原15肽(E-365GGADSMSMAGMAVSYE-379)cDNA序列,与pGEX-KG构建重组表达质粒,诱导表达重组多肽并进行western blot验证.经过4轮筛选后,噬菌体得到高度富集,挑取单克隆采用MAb包被进行ELISA鉴定,有22个克隆呈阳性.对重组多肽进行western blot验证,结果表明该重组多肽能够特异结合兔抗JEV多克隆抗体.本实验成功筛选出JEV结构蛋白E的特异性噬菌体模拟表位,为开展用JEV抗原表位探索JEV的防制研究创造了条件,为多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要依据.     

基于DELPHI的双屏显示系统的设计与实现

计算机双屏显示是计算机技术与可视化技术相结合的一种新应用.双屏显示系统帮助提高工作效率,避免频繁切换窗口.本文提出了双屏显示的概念,并详细分析了该技术的实现细节,最后介绍了它在实际操作中的应用.     

噬菌体表面展示技术的发展及应用

随着噬菌体展示技术自身建库、筛选方法等方面的进一步改进和完善,目前已被广泛应用于生命科学的许多领域,特别是噬菌体表面展示技术在蛋白质相互作用方面的成功应用,为筛选新的结合蛋白提供了一种简单、有效的手段,还为功能基因组学的研究提供了一个新的方法。该技术还在药物研制和疾病机理方面显示出很大的应用潜力,目前已成为筛选对人类疾病有诊断和治疗价值的生物活性分子的重要手段,并已广泛用于癌症、艾滋病、心血管病、组织器官移植、神经性疾病等领域药物的研究和开发。     

mRNA差异显示技术及其改进

分子生物学的首要任务之一就是比较不同细胞间或同一细胞不同时间与空间基因表达的差异。在多种基因检测技术中 ,mRNA差异显示技术作为研究细胞、组织在不同条件下 ,基因表达水平差异的重要手段 ,以不可替代的优势已被广泛用于生物学领域。该技术与传统的消减杂交等方法进行比较具有简便、快捷、灵敏、高效等优点 ,但也存在假阳性率高、易污染等缺点。为了克服以上缺点又不断涌现出一些改进技术。文章对该技术的原理、优势与不足及主要改进进行了综述     

东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库的构建

本项研究的目的是构建东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库,为筛选东方田鼠抗血吸虫病抗性相关基因奠定基础.用TRIzol试剂提取东方田鼠肝脏总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA.在双链cDNA末端加上EcoRⅠ/HindⅢ定向接头并用EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切,使其两端分别带EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端.用Mini Column纯化、收集300 bp以上的双链cDNA片段,再连接于带有EcoRⅠ和HindⅢ末端的T7 Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示cDNA文库.经测定,库容量为1.3×107 PFU/mL,扩增后文库滴度为1.8×1011 PFU/mL.对从原始文库中随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为91.7%,阳性克隆片段大小分布在200 bp～1 000 bp,其中有95.5%的插入片段大于300 bp.用日本血吸虫童虫可溶性抗原对文库进行了初筛,得到了21个ESTs,将这些阳性噬菌体克隆和血吸虫童虫共培养,其中大部分克隆诱导的童虫死亡率比阴性噬菌体对照高出2%～13%.     

鸡大肠杆菌活的非可培养状态发生相关基因克隆与分析

本研究旨在从分子水平探究细菌活的非可培养状态(VBNC)的发生机制。应用冰乙酸和4℃联合诱导条件,使鸡大肠杆菌进入VBNC状态,并利用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)获得VBNC相关基因。结果表明,从VBNC大肠杆菌中筛选得到的3个差异片段与大肠杆菌23S核糖体RNA基因序列具有较高的核苷酸同源性,分别为98%、98%和99%,而氨基酸的同源性也均在97%以上,表明这3个序列是大肠杆菌23S核糖体rRNA基因的部分序列,同时也是与大肠杆菌VBNC状态发生密切相关的基因。由此推知,当正常大肠杆菌在未暴露任何压力下时,其转录水平较低,特别是23S rRNA的某一(些)基因不显示或受到强烈抑制。当进入VBNC状态后,面临生存压力时,这一(些)基因转录水平明显强于正常状态,而核糖体作为蛋白质合成的主要结构与场所,其某些基因也将积极参与新蛋白质的生物合成。     

猪瘟病毒E2基因噬菌体展示多肽库的构建及表位鉴定

本研究通过建立CSFV噬菌体展示多肽库,并对其进行生物淘选,以期获得E2蛋白上新的抗原表位.选择CSFV石门株(SM)和疫苗株(HCLV)为代表株,采用噬菌体展示技术,以T7select415-1b为载体,分别构建了CSFV SM株和HCLV株E2基因噬菌体展示多肽库(SM-E2库和HCLV-E2库).通过生物淘选和噬菌体原位杂交技术,采用7株猪瘟单克隆抗体和1株猪瘟高免血清分别对构建的SM-E2库和HCLV-E2库进行抗原表位筛选.结果共筛选到了5条与E2蛋白高度同源的序列,在E2蛋白上的同源区域分别为TAVSPTTLR、YYEP、TTWKEYSH、GGQ(V)VK和PDGLPHY.结果表明,TAVSPTTLR、YYEP和TTWKEYSH序列与目前已知E2蛋白表位一致,说明它们是E2蛋白上的优势表位;GGQ(V)VK和PDGLPHY序列与预测表位一致,推测是E2蛋白上潜在的抗原表位.     

猪流行性腹泻病毒S蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea,PED）是一种高度接触性肠道传染性疫病,主要危害1周龄以内的仔猪,仔猪感染死亡率高达100%,是目前危害世界养猪业的主要疫病之一。本研究旨在制备针对猪流行性腹泻病毒S蛋白的特异性纳米抗体并鉴定其结合活性。作者原核表达并纯化PEDV S1蛋白,将纯化后的PEDV S1重组蛋白免疫双峰驼,第4次免疫后分离其外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞RNA,反转录得到cDNA,通过巢式PCR扩增VHH片段,并构建至pCANTAB-5E载体中,电转化至TG1感受态细胞,得到VHH噬菌体抗体展示文库;随后,对构建的噬菌体抗体展示文库进行救援和3轮富集,利用噬菌体展示技术从中筛选针对PEDV S蛋白纳米抗体,通过ELISA验证筛选的纳米抗体的特异性和结合力。通过Western blot和间接免疫荧光验证纳米抗体与PEDV的结合活性。结果显示：成功表达并纯化PEDV S1蛋白,经4次免疫后,双峰驼血清中的特异性抗体效价达到了1∶256 000。构建的噬菌体展示文库的库容量为2.1×10⁷,阳性率85%;对噬菌体展示文库3轮的淘选富集后,最终筛选出6株氨基酸序列不同的纳米抗体,ELISA结果显示,6株纳米抗体均对PEDV S1重组蛋白具有良好的结合力与特异性。随后验证了Nb3能够与PEDV结合,表明其具有良好的活性。成功筛选到针对PEDV S1蛋白的特异性纳米抗体,所筛选纳米抗体有望用于PED的诊断和治疗,同时为PEDV的致病机制研究提供抗体材料。     

Screening for Differential Gene Expression in Atropa belladonna Leafy Gall Induced Following Rhodococcus fascians Infection

To better characterise at the molecular level the nature of plant responses to infection by Rhodococcus fascians PCR-based differential display patterns of Atropa belladonna leafy gall (LG) and non-infected plant tissues were compared. Six differentially expressed genes were identified and their altered expression was confirmed by RT-PCR. Three of them corresponded to up-regulated genes which encode proteins involved in plant defence. The three remaining cDNA fragments which correspond to down-regulated genes in LG, encoded proteins with similarity to a multicystatin, a miraculin and a methallothionein-like protein, respectively. Upon elimination of the bacteria from infected plant tissue, the expression of up-regulated genes was maintained, whereas expression of down-regulated genes resumed suggesting a potential role of these up-regulated genes in plant growth and development.     

A New Cell Wall Located N-rich Protein is Strongly Induced During the Hypersensitive Response in Glycine Max L.

Soybean (Glycine max (L.) Merill, cv. Williams 82) plants and cell cultures respond to avirulent pathogens with a hypersensitive reaction. After inoculation of soybean with Pseudomonas syringae pv. glycinea, carrying the avirulence gene avrA, or zoospores from the fungus Phytophthora sojae Race 1, a resistance-gene-dependent cell death programme is activated. A new gene was identified by differential display of mRNAs that is specifically activated during the early phase of incompatible pathogen-soybean interactions but does not respond to compatible pathogens. The gene is strongly induced within 2h after addition of P. sojae zoospores. A similar kinetic pattern was observed for P. syringae (avrA) inoculated soybean cell cultures. The gene encodes a deduced protein of 368 amino acids with a very high content of asparagine and was therefore termed N-rich protein (NRP). The protein is composed of two distinct domains, of which only the C-terminal domain has striking homology to proteins of unknown function from other plants. An antibody raised against the recombinant NRP recognizes a protein of 42kDa. The protein is located in the cell wall as indicated by cell fractionation studies. Comparison of the genomic DNA-sequence with the cDNA, identified two introns within the open reading frame. The NRP-gene is not directly induced by salicylic acid or hydrogen peroxide, indicating a distinct and specific signal transduction pathway which is only activated during programmed cell death. The NRP-gene appears to be a new marker in soybean activated early in plant disease resistance.