多鳞鱚vhl基因克隆及其低氧胁迫下的表达变化

[目的]克隆多鳞鱚林岛综合征基因(vhl)并分析其在低氧胁迫下的表达变化,为揭示多鳞鱚应对低氧的适应机制提供研究资料,也为今后开展多鳞鱚新品种选育提供候选基因.[方法]采用PCR克隆多鳞鱚vhl基因cDNA全长序列,利用EditSeq、SMART、Signal IP 4.1及ClustalX等在线软件进行生物信息学分析;并以半定量PCR检测多鳞鱚vhl基因在不同组织中的表达情况,采用实时荧光定量PCR分析低氧胁迫对多鳞鱚vhl基因在鳃组织和心脏中表达的影响.[结果]多鳞鱚vhl基因cDNA序列全长727 bp,包括120 bp的5'端非编码区(5'-TUR)、106 bp的3'端非编码区(3'-TUR)和504 bp的开放阅读框(ORF),共编码167个氨基酸残基,编码蛋白存在4个结构域,即Pfam:VHL(第12~93位氨基酸)、Pfam:VHL_C(第5~22、31~39和98~153位氨基酸)、ParB结构域(第100~162位氨基酸)和SOCS_box结构域(第104~140位氨基酸).多鳞鱚vhl氨基酸序列与盲曹鱼vhl氨基酸序列的同源性最高(81%),但系统发育进化分析结果显示多鳞鱚与攀鲈的亲缘关系最近.多鳞鱚vhl基因在不同组织中均有表达,其中以鳃组织、卵巢和精巢的表达量较高,其次是心脏和肝脏,在肌肉和脑组织的表达量较低.经低氧胁迫后,多鳞鱚vhl基因在鳃组织中的相对表达量显著上调(P<0.05,下同);在心脏中表现为随低氧胁迫时间的延长显著上调,恢复氧气4 h后vhl基因的相对表达量虽然呈显著下调趋势,但仍显著高于正常水平.[结论]多鳞鱚vhl基因编码蛋白存在Pfam:VHL、Pfam:VHL_C、ParB和SOCS_box等4个结构域,且低氧胁迫前后其表达量存在显著差异,即多鳞鱚vhl基因在低氧应答信号通路中扮演着重要角色.     

番木瓜CpTIFY10A-like基因克隆及表达分析

[目的]克隆番木瓜CpTIFY10A-like基因序列,并分析其表达特性,为探索该基因功能和抗番木瓜环斑病毒(PRSV)分子机制提供理论依据.[方法]结合前期研究的抗PRSV转录组数据,利用RACE对上调表达基因Cp-TIFY10A-like进行克隆,获得该基因cDNA全长序列,分析其编码区序列(CDS)及进行生物信息学分析.利用已鉴定的PRSV对3月龄番木瓜植株进行不同处理,以感染PRSV且出现病症的植株(CK+)、1.0 mL/L禾甲安(CTS-N)灌施感染PRSV且出现病症的植株(B)为处理组,以清水灌施(不添加禾甲安)不感染PRSV的植株(CK-)为对照组,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同处理下PRSV基因和CpTIFY10A-like基因在番木瓜叶片中的表达情况.最后将CpTIFY10A-like基因CDS序列连接至pET28a-sumo载体上构建原核表达载体,转化Rosetta(DE3)感受态细胞,通过不同浓度IPTG诱导蛋白表达,利用SDS-PAGE电泳检测原核表达情况.[结果]CpTIFY10A-like基因全长为1352 bp,CDS序列为822 bp,编码273个氨基酸残基;其编码蛋白理论等电点(pI)9.23,不稳定系数62.97,亲水性平均系数-0.458,属于不稳定的亲水性碱性蛋白,定位在细胞核上,其二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,同时含有少量的β-折叠和延伸链.CpTIFY10A-like蛋白与酸枣和白梨TIFY蛋白的氨基酸序列相似性较高,均含有特定的TIFY结构域,属于TIFY蛋白家族,三者在系统发育进化树上聚在同一分支,表明亲缘关系较近.不同处理的番木瓜叶片中,PRSV基因的相对表达量排序为CK+(1.02)>B(0.39)>CK-(0),CpTIFY10A-like基因的相对表达量排序为B(53.12)>CK+(1.15)>CK-(1.02),且CpTIFY10A-like基因在经禾甲安处理的感染PRSV番木瓜叶片中相对表达量显著升高(P<0.05,下同),而PRSV基因的相对表达量显著降低.CpTIFY10A-like基因在原核细胞中表达蛋白的分子量与理论分子量(29.36 kD)相符,且不同浓度IPTG诱导下,IPTG浓度越高,蛋白表达量越多,表明该基因在原核细胞中成功表达.[结论]禾甲安可诱导CpTIFY10A-like基因高效表达,进而通过茉莉酸通路起调节作用以抵抗PRSV感染,即CpTIFY10A-like基因在番木瓜抗PRSV过程中发挥重要调控作用.     

OCX-32基因内含子变异对长顺绿壳蛋鸡蛋壳品质的影响

[目的]探讨OCX-32基因对长顺绿壳蛋鸡蛋壳品质的遗传效应,为长顺绿壳蛋鸡的保种选育及开发利用提供参考依据.[方法]以长顺绿壳蛋鸡为材料,采用PCR产物直接测序法筛选OCX-32基因SNP多态位点,实时荧光定量PCR检测组织表达谱,运用SPSS 19.0广义线性模型(GLM)分析SNP位点基因型或双倍型与所测定性状指标的相关性.[结果]在长顺绿壳蛋鸡OCX-32基因中检测到3个SNPs位点,分别是位于内含子1上的g.22592323G>T及内含子3上的g.22597350T>C和g.22597555G>A.卡方(χ2)检测结果发现,g.22597350T>C位点的基因型分布显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.05,下同).连锁不平衡分析结果显示,3个SNPs突变位点不存在强连锁不平衡,共发现4种单倍型和8种双倍型,单倍型H1和双倍型H1H2频率最高,分别为0.523和0.345.实时荧光定量PCR检测结果显示,OCX-32基因在长顺绿壳蛋鸡12个组织中存在不同程度的表达,表达量排序为肾脏>心脏>子宫>腹脂>小肠>脾脏>肝脏>腺胃>胸肌>胰腺>肺脏>肌胃.关联分析结果显示,g.22597350T>C位点CC基因型在蛋壳强度和蛋壳重2个品质指标上显著高于CT基因型和TT基因型;双倍型H4H4个体的蛋壳强度显著高于其他7种双倍型个体,蛋壳重显著高于H2H4个体.[结论]OCX-32基因内含子变异能影响长顺绿壳蛋鸡蛋壳品质,检测到的3个SNPs位点可作为鸡蛋壳品质选择的遗传分子标记,其中突变位点g.22597350T>C的CC基因型和双倍型H4H4是影响蛋壳强度和蛋壳重的关键基因型和双倍型,有利改善蛋壳品质.     

猪miR-124靶向IQGAP2调节巨噬细胞内沙门氏菌的增殖

[目的]明确猪miR-124与其靶基因IQGAP2间的表达调控关系,以及miR-124表达水平与猪巨噬细胞内沙门氏菌数量的关联,为揭示沙门氏菌在感染细胞内存活与增殖的机制提供理论依据.[方法]通过荧光素酶报告基因系统验证miR-124与IQGAP2基因的作用位点;再以GM-CSF诱导的猪巨噬细胞和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)为试验材料,通过实时荧光定量PCR和流式细胞术测定沙门氏菌感染猪巨噬细胞中miR-124和IQGAP2基因的表达及巨噬细胞内沙门氏菌的增殖情况.[结果]miR-124结合位点野生型载体转染的荧光报告信号显著低于miR-124结合位点突变载体(P<0.05,下同),但共转染anti-miR-124序列后能显著增强miR-124结合位点野生型载体的荧光报告信号.经沙门氏菌感染后,猪巨噬细胞中的miR-124表达被激活,感染12、24和48 h后的相对表达量均显著高于沙门氏菌感染前(0 h),而IQGAP2基因表达水平呈显著下调趋势;在沙门氏菌感染猪巨噬细胞内,miR-124表达水平与IQGAP2基因表达水平呈明显负相关(r=-0.92).miR-124高表达组细胞内的沙门氏菌数量显著高于正常巨噬细胞,但miR-124敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量显著低于正常巨噬细胞;IQGAP2基因敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量显著高于正常巨噬细胞;此外,miR-124高表达+IQGAP2基因敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量与IQGAP2基因敲低表达处理组相比无显著差异(P>0.05),但显著高于miR-124高表达组细胞.[结论]沙门氏菌感染猪巨噬细胞中的miR-124表达水平与IQGAP2基因表达水平及胞内沙门氏菌数量呈负相关,即沙门氏菌可通过上调miR-124表达靶向抑制IQGAP2基因表达,从而调节其在猪巨噬细胞内的增殖.     

酵母单杂交文库构建及巨峰葡萄VvFT基因启动子上游调控因子筛选

[目的]利用酵母单杂交文库筛选巨峰葡萄VvFT基因启动子上游调控因子,挖掘参与调控葡萄开花时间的因子,为揭示花期转变代谢通路和定向改良葡萄品种提供理论参考.[方法]利用PlantCARE分析预测VvFT基因启动子顺式作用元件,并以VvFT基因启动子为诱饵,利用酵母单杂交文库筛选技术,筛选作用在VvFT基因启动子上游的调控因子.[结果]葡萄VvFT基因启动子区域存在13种启动子顺式作用元件,包括A-box、CAAT-box和TATA-box组成型调控元件;光响应调控元件ATC-motif、Box 4、G-Box和GT1-motif;茉莉酸甲酯(MeJA)响应调控元件CGTCA-motif和TGACG-motif;干旱诱导的MYB结合位点元件MBS;玉米蛋白代谢必需的调控元件O2-site;参与生物钟控制的调控元件circadian;厌氧诱导必需调控元件ARE.以VvFT基因启动子为诱饵,筛选获得34条表达序列标签(EST),其中有21条为未知功能,有13条在植物生长、抗逆防御、信号转导、转录调控、蛋白酶等方面均有已知或预测的功能,包括转录抑制因子ft41、GRF1互作因子ft44、NAP1相关蛋白ft64及ft70分子伴侣DnaJ10.酵母单杂交点对点验证结果表明VvDnaJ10和VvFT基因启动子之间有相互作用.[结论]通过酵母单杂交文库筛选获取13条候选EST,虽然大部分EST功能预测分析结果与VvFT调控开花时间无明显的直接关系,但研究结果为进一步探索VvFT转录或表达水平控制葡萄开花时间的分子机制提供侯选基因.     

江苏近年育成粳稻新品种/系的稻瘟病抗性基因及穗颈瘟抗性分析

【目的】明确水稻品种携带的抗稻瘟病基育种应用价值,是利用抗病基因培育抗病品种控制病害流行的重要前期工作。【方法】利用功能标记分析了14个抗稻瘟病基因在江苏近年育成的195个粳稻新品种/系中的分布情况,并对其中158个品种和17份携带抗稻瘟病基因Pigm的高世代回交株系进行穗颈瘟接种鉴定。【结果】大多数品种携带2~5个抗病基因,但所有品种均不含有Pigm基因;Pib、Pita和Pikh基因在供试品种中的分布频率较高,均在45%以上,其余基因均在30%以内;Pid3、Pid2、Pia、Pb1在新育成品种中的出现频率明显高于审定品种。测试品种对穗颈瘟的抗性主要与3个基因显著相关,贡献率由高至低依次为Pia、Pi3/5/i和Pita;其中,Pia或Pi3/5/i与Pita间的聚合效应均显著高于各基因单独存在时的抗病效应,且以Pia和Pita间的聚合效应最强,携带该基因组合的所有品种对穗颈瘟均表现抗至高抗水平抗性。回交导入Pigm基因的所有17份株系对穗颈瘟的抗性均显著高于各自轮回亲本,且均达到了抗病以上水平。【结论】抗病基因Pigm及基因组合“Pia+Pita”在江苏粳稻抗穗颈瘟育种中具有重要的育种应用价值。     

中国不同春麦区小麦地方种质抗条锈病评价及抗性基因分析

为明确中国不同春麦区小麦地方种质对当前小麦生产上流行的条锈病菌Puccinia striiformis f.sp.tritic的抗性水平及其所含抗性基因,利用条锈病菌生理小种条中32（CYR32）和条中34（CYR34）及混合生理小种（致病类群）对来自5个春麦区的196份小麦地方种质进行苗期、成株期抗性鉴定,并通过6个已知条锈病抗性基因Yr9、Yr18、Yr26、Yr48、Yr65和Yr67对其所含重要抗性基因进行分子标记检测。结果显示,在苗期,有11份小麦地方种质对CYR32表现出抗性,有12份对CYR34表现出抗性,分别占供试种质总数的5.61%和6.12%;有6份对CYR32和CYR34均表现出抗性;在成株期,有59份小麦地方种质在5个田间诱导环境下表现出稳定的抗性。有119份小麦地方种质检测到含抗性基因,其中有3份携带Yr9,有50份携带Yr18,有43份携带Yr48,有54份携带Yr65,所有供试种质均未检测到Yr26和Yr67,抗性基因的组合分析发现,共有31份小麦地方种质携带4种抗性基因组合类型Yr9+Yr18、Yr18+Yr48、Yr18+Yr65和Yr48+Yr65。表明来自中国5个春麦区的小麦地方种质条锈病抗性表型呈多样性,且携带目前在小麦抗病育种和生产上有效的条锈病抗性基因（组合）,建议加大对小麦地方种质的保护和应用力度。     

美国EPA再次确认草甘膦非致癌性

美国环保署(EPA)发布了除草剂草甘膦的最终临时再评价决定,重申草甘膦不是致癌物可以安全使用,并允许草甘膦继续大范围使用。EPA发现,按照法定标签规定使用草甘膦,“没有需要令人关注的风险”,并扩大了其在玉米、大豆、棉花、油菜和甜菜等100多种食品作物上的登记使用,这些作物已通过耐除草剂基因改造。EPA估计,农民每年使用约2.81亿磅(12.7万吨)草甘膦,另外有2400万磅用于非农业场所,其中500万磅由消费者喷洒。     

基于DNA条形码的红翅大小蠹和黄杉大小蠹分子鉴定

外来有害生物的快速准确鉴定有助于提高口岸检疫效率。红翅大小蠹(Dendroctonus rufipennis)和黄杉大小蠹(D. pseudotsugae)作为大小蠹属的非中国种是我国口岸原木检疫中频繁截获的检疫性有害昆虫。本研究以mtDNA COI基因5′端和3′端序列为标记对红翅大小蠹与黄杉大小蠹的11个样本开展分子鉴定有效性评价。结果显示,当以COI基因5′端和3′端为靶标时,两种大小蠹间的平均遗传距离分别为0.181和0.144,是种内遗传距离的60.3和48倍,且种内、种间遗传距离间无重叠现象,在系统发育树上都能聚为独立的分支,表明mtDNA COI基因5′端和3′端序列均可有效区分红翅大小蠹与黄杉大小蠹。     

利用RecTE基因重组体系构建hrpS基因缺失型冠菌素工程菌株

冠菌素 (coronatine, COR) 是一种新型植物生长调节剂,能有效调控植物生长,增强植物抗逆性。目前冠菌素主要通过微生物菌株发酵的方式获得,而菌株自身产率低是限制冠菌素应用的最大问题。为了开发冠菌素高产菌株,本研究以模式菌株丁香假单胞菌番茄致病变种Pseudomonas syingae pv. tomato DC3000为出发菌株,利用RecTE基因重组体系对菌株Pst DC3000中hrpS基因进行了敲除,并成功筛选到基因重组菌株H1-20。对H1-20菌株进行发酵培养,结果表明,H1-20菌株中冠菌素的产量达到了22.67 mg/L,是出发菌株冠菌素产量的2.36倍。本研究通过RecTE基因重组体系,成功地构建了冠菌素工程菌株H1-20,为产冠菌素菌株提供了更多选择,为后续进一步开展冠菌素高产菌株改造工作奠定了基础。