Occurrence,Virulence Genes and Antibiotic Resistance of Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) from Twelve Bovine Farms in the North‐East of Ireland

Cattle faecal samples (n = 480) were collected from a cluster of 12 farms, and PCR screened for the presence of the intimin gene (eae). Positive samples were cultured, and colonies were examined for the presence of eae and verocytotoxin (vtx) genes. Colonies which were positive for the intimin gene and negative for the verocytotoxin genes were further screened using PCR for a range of virulence factors including bfpA, espA, espB, tir ehxA, toxB, etpD, katP, saa, iha, lpfA_{O157/OI‐141} and lpfA_{O157/OI‐154.} Of the 480 faecal samples, 5.8% (28/480) were PCR positive, and one isolate was obtained from each. All 28 isolates obtained were bfpA negative and therefore atypical EPEC (aEPEC). The serotypes detected included O2:H27, O8:H36, O15:H2, O49:H+, O84:H28, O105:H7 and O132:H34 but half of the isolates could not be serogrouped using currently available antisera. Twenty‐two (79%) of the isolates carried the tir gene but only 25% were espB positive, and all other virulence genes tested for were scarce or absent. Several isolates showed intermediate resistance to ciprofloxacin, kanamycin, nalidixic acid, minocycline and tetracycline; full resistance to nalidixic acid or tetracycline with one isolate (O?:H8) displaying resistance to aminoglycosides (kanamycin and streptomycin), quinolones (nalidixic acid) and sulphonamides. This study provides further evidence that cattle are a potential source of aEPEC and add to the very limited data currently available on virulence genes and antibiotic resistance in this pathogenic E. coli group in animals.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒糖基化囊膜蛋白5原核表达载体的构建及免疫原性分析

为分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)糖基化囊膜蛋白5（GP5）的免疫原性,本研究通过提取PRRSV分离株（GenBank登录号：HQ701732.1）RNA和RT-PCR扩增得到开放阅读框5（ORF5）基因。根据ORF5的基因序列,设计2对引物,经PCR扩增分别获得不含信号肽和跨膜功能区的2段基因片段。利用酶切位点,将2段基因连接到原核表达载体pET-28a（+）上,获得重组表达质粒pET28a-GP5。将重组质粒导入BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导获得表达。经Western blotting鉴定,重组蛋白可被PRRSV阳性血清识别。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA方法检测,小鼠能产生针对蛋白的血清抗体。因此,该重组PRRSV GP5蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究GP5蛋白的结构和功能奠定基础。     

2012―2013年猪繁殖与呼吸综合征病毒河南流行株的分离鉴定及分子流行病学调查

为了解河南地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）流行毒株的遗传变异情况和发展趋势。通过RT-PCR方法,对2012―2013年采自河南省各地疑似病料进行PRRSV检测,并对阳性病料进行病毒分离鉴定及分子流行病学分析。结果显示：54份疑似病料中17份检测为阳性,阳性率为31.5%,并分离出3株PRRSV;通过完整的ORF5基因和部分NSP2基因序列遗传进化分析表明,河南地区流行毒株主要为美洲型PRRSV,且17份阳性样品中10份与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）高度同源、2份与经典PRRSV高度同源、另外5份与美洲流行毒株NADC30高度同源,该类毒株的NSP2基因在不同部位存在393个核苷酸缺失,国内尚未见相关报道。结果表明,2012―2013年河南地区PRRSV主要流行毒株为HP-PRRSV,同时出现了新的变异毒株,使河南地区乃至我国PRRSV变异种类更加多样化,提示加强PRRSV流行及变异的监测十分必要。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

为建立一种快速、灵敏、简便的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）早期检测方法,本研究利用逆转录环介导恒温扩增技术（RT-LAMP）,针对PRRSV的ORF5基因片段设计了4条引物,利用Bst DNA聚合酶在65 ℃恒温条件下进行逆转录扩增,通过1.0%琼脂糖凝胶电泳和加入SYBR Green Ⅰ染料肉眼判断结果,建立了PRRSV RT-LAMP检测方法。结果表明,该检测方法具有良好的特异性,与其他常见病毒如猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒等无交叉反应,较普通RT-PCR灵敏性高100倍。采用RT-LAMP和RT-PCR分别对10份临床样本同时进行检测,符合率为100%。因此,本研究建立的RT-LAMP是一种可适用于临床PRRSV检测的快速、简单、灵敏、特异的检测方法。     

一种改进的尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR检测方法

为实现荧光定量PCR对土壤病原真菌数量更为高效、灵敏的检测,本研究将液体培养的孢子悬浮液和长年耕作的水稻土制作成孢子浓度为4×10~1~4×10~6 spore/g的带菌土,采用MoBio PowerSoil@DNA Isolation Kit提取模拟带菌土壤总DNA,引入常规PCR预扩增包含qPCR目标序列的1 446bp片段,以预PCR产物为模板进行qPCR,构建荧光定量PCR标准曲线。研究结果表明:以试剂盒提取的带菌土壤总DNA为模板绘制的qPCR标准曲线相关系数r为0.985,检测下限为4×10~3 spore/g土;引入预PCR后,qPCR标准曲线相关系数r为0.974,检测下限为4×10~2 spore/g土,较未引入时提高了10倍,结合不同土壤病原真菌的特异性引物,该检测方法可为土壤病原真菌的有效定量检测提供技术支撑。     

肠致病性大肠杆菌DPO-PCR快速检测方法的建立

为建立肠致病性大肠杆菌(EPEC)的快速检测方法,本研究以EPEC bfp A基因为靶基因设计了一对双启动寡核苷酸引物(DPO),建立了EPEC的DPO-PCR快速检测方法。结果显示,退火温度在45℃~65℃范围内均能够高效地扩增出目的基因,表明DPO引物对退火温度不敏感。该方法对其他菌株的扩增结果均为阴性,特异性强;其灵敏度为97 cfu/m L。利用该方法和国标法分别对采集的230份临床样品进行检测,均共计检出5份EPEC阳性样品,两者符合率为100%。本研究建立的DPO-PCR方法设计简单、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性,为快速准确检测EPEC提供新的检测手段。     

啤酒酵母甘露聚糖的提取及其对鸡肠道微生物区系的影响

研究了甘露聚糖复合物的提取技术,确立了该复合物的制备工艺,分析了甘露聚糖的化学组成.结果表明,该复合物是含蛋白质的多糖,其蛋白质的氨基酸组成具有明显的特征性,苏氨酸和丝氨酸的含量较高,而蛋氨酸相对较少.在饲料中添加MOS饲喂雏鸡至第10日,可使粪便中的大肠杆菌数量显著降低(P＜0.05),而乳杆菌数量极显著提高(P＜0.01).     

三株芽孢杆菌抑菌活性分析及对肉鸡舍空气微生物的影响

【目的】分析2株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和1株苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的基本特性以及对大肠埃希氏菌（Escherichia.coli,CVCC1570）的抑制活性;分析3株芽孢杆菌复合制剂对肉鸡舍空气大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用,为改善畜舍环境提供基础数据。【方法】对3株芽孢杆菌进行形态学观察、镜检和生长曲线测定,以大肠埃希氏菌（CVCC1570）为指示菌株,采用琼脂扩散法对单一菌株的抑菌特性进行测定,筛选出适宜的抑菌浓度;利用三因子三水平的正交试验设计,筛选出最佳抑菌效果的复合芽孢杆菌组合;鸡舍喷洒试验采用单因子设计,分为3个处理组,每个处理设3个重复,分别为空白对照组,化学消毒剂阳性对照组（苯扎氯铵）,喷洒复合芽孢杆菌菌剂处理组。在肉鸡不同日龄检测鸡舍内大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的变化规律。【结果】3株芽孢杆菌为革兰氏阳性需氧菌。芽孢杆菌SKN01和芽孢杆菌SKN02生长曲线相近,在培养2h开始进入对数生长期。芽孢杆菌SKN03生长较缓慢,进入对数生长期的时间相对较长。单一菌株对大肠埃希氏菌有效抑菌浓度均为108CFU•mL-1。经正交试验测定,3株芽孢杆菌复合菌液最佳抑菌组合为4×108 CFU•mL-1、4×108 CFU•mL-1、6×108 CFU•mL-1。最佳组合复合芽孢杆菌喷洒鸡舍,能够有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长,在肉鸡生长后期复合制剂的抑菌效果明显。【结论】3株芽孢杆菌能够有效抑制大肠埃希氏菌,同时复合菌液能够有效减少鸡舍有害微生物的数量,起到改善鸡舍环境的作用。     

EGF和FGF-2对猪皮下脂肪神经嵴干细胞增殖和分化的影响

【目的】探究表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）和成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2,FGF-2）对猪皮下脂肪神经嵴干细胞（neural crest stem cells,NCSCs）增殖及分化的影响,以优化猪皮下脂肪神经嵴干细胞的培养条件。【方法】通过体外分离培养原代猪皮下脂肪NCSCs,免疫荧光染色鉴定NCSCs标志物p75 NTR,并用不同浓度的EGF和FGF-2（0和0、10和10、10和20、20和10、20和20、30和30 ng/mL）作用于传代猪皮下脂肪NCSCs,用CCK-8试剂盒测定细胞增殖率,确定细胞生长的最适EGF和FGF-2浓度,将试验分为空白组和最适浓度组,测定两组细胞的生长曲线,成脂化诱导后油红O染色,对比两组细胞的脂滴生成量。【结果】免疫荧光染色结果显示,原代猪皮下脂肪NCSCs经p75 NTR鉴定呈阳性。CCK-8细胞增殖试验结果显示,EGF和FGF-2的浓度均为20 ng/mL时对传代猪皮下脂肪NCSCs的促增殖作用最佳。生长曲线显示,两组细胞均在第5~9天处于对数生长期,第10~15天细胞增殖减缓,逐渐到达停滞期。油红O染色结果显示,最适浓度组胞质内的脂滴生成量远多于对照组。【结论】在培养液中添加20 ng/mL EGF和20 ng/mL FGF-2对猪皮下脂肪NCSCs的增殖和分化有促进作用。     

中药对鸡致病性大肠埃希菌的体外抑菌试验

为研究25种中药对秦皇岛地区鸡致病性大肠埃希菌(Escherichia coli)地方流行株QH1(O78)、QH2(O89)、QH4(O1)的体外抑菌效果,以E.coli标准株ATCC25922作为质控菌株。利用水提法制备中药药液,使终浓度为1g/mL;用平板琼脂打孔法和改良微量二倍稀释-平板法分别测定25种中药的抑菌圈直径和最小抑菌浓度(MIC)。结果表明,金银花、黄连、乌梅、五味子4种中药对鸡致病性E.coli地方株极度敏感,抑菌圈直径在20.3mm~22.7mm之间,其MIC在15.65mg/mL~31.25mg/mL之间;其他药物对鸡致病性E.coli地方株有不同程度的敏感性,为鸡致病性E.coli地方株中药防治提供理论基础。