猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列（GenBank登录号：XM_003124236.4）设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a（+）连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。     

抗奶牛乳房炎高免卵黄抗体的研制

奶牛乳房炎是影响奶牛的三大主要疾病之一,临床上将本病分为临床型及隐性型。本试验将2种临床类型中4种病原菌按比例配制成复合菌苗,对60只390日龄的健康蛋鸡进行免疫接种,提取卵黄制成抗奶牛乳房炎卵黄抗体。并进行了初步临床应用试验,结果显示高免卵黄抗体对奶牛乳房炎的治疗有较好的效果。     

Emerging viral zoonoses: frameworks for spatial and spatiotemporal risk assessment and resource planning

Spatial epidemiological tools are increasingly being applied to emerging viral zoonoses (EVZ), partly because of improving analytical methods and technologies for data capture and management, and partly because the demand is growing for more objective ways of allocating limited resources in the face of the emerging threat posed by these diseases. This review documents applications of geographical information systems (GIS), remote sensing (RS) and spatially-explicit statistical and mathematical models to epidemiological studies of EVZ.Landscape epidemiology uses statistical associations between environmental variables and diseases to study and predict their spatial distributions. Phylogeography augments epidemiological knowledge by studying the evolution of viral genetics through space and time. Cluster detection and early warning systems assist surveillance and can permit timely interventions. Advanced statistical models can accommodate spatial dependence present in epidemiological datasets and can permit assessment of uncertainties in disease data and predictions. Mathematical models are particularly useful for testing and comparing alternative control strategies, whereas spatial decision-support systems integrate a variety of spatial epidemiological tools to facilitate widespread dissemination and interpretation of disease data. Improved spatial data collection systems and greater practical application of spatial epidemiological tools should be applied in real-world scenarios.     

鸭疫里默氏菌病和大肠杆菌病多重PCR诊断方法的建立

参考GenBank中鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的外膜蛋白A(OmpA)基因序列,应用PrimerPremier5.0软件在二者高度保守区设计了2对引物,建立了适合鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的快速检测的多重PCR检测方法。以该方法对已分离并保存的鸭疫里默氏菌和大肠杆菌进行PCR扩增,分别扩增出与试验设计相符的670、408bp的特异性DNA片段。将扩增所得的DNA片段进行克隆测序,测序结果表明分别为鸭疫里默氏菌和大肠杆菌OmpA基因序列。该方法对鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的检测下限分别为4×104CFU/mL和3×104CFU/mL。表明所建立的PCR方法具有特异、快速和敏感的特点,可用于诊断鸭疫里默氏菌、大肠杆菌以及两者的混合感染。     

PCV-2感染对PK-15细胞IL mRNA转录水平的影响

【目的】观察猪圆环病毒2型（PCV-2）感染对猪肾传代细胞（PK-15细胞）炎性细胞因子白细胞介素（IL） mRNA转录水平的影响,探讨宿主与病毒之间的作用关系及细胞炎性反应机制。【方法】以未感染PCV-2的PK-15细胞为对照组,运用相对定量PCR技术,测定和分析PCV2感染PK15细胞后,PCV-2 DNA相对含量的变化,以及炎性细胞因子IL-6、IL-8、IL-12p35、IL-12p40、IL-13、IL-17、IL-18 mRNA转录水平在1,6,12,24,48,和72 h的变化。【结果】PCV-2感染后,PK-15细胞的IL-6、IL-13、IL-17、IL-18 的mRNA转录水平在12 h显著增加,24 h后mRNA转录水平下降;IL-8的mRNA转录水平在48 h时最高,为对照组的2.5倍,但72 h时恢复至与对照组水平相当;随着感染时间的延长,IL-12p35、IL-12p40 的mRNA转录水平显著下降。【结论】PCV-2感染后可引起PK-15细胞中IL-6、IL-8、IL-13、IL-17、IL-18等细胞因子mRNA转录水平增加,而IL-12 mRNA转录水平下降,提示PCV-2感染后引起的PK-15细胞炎性反应与其分泌的炎性细胞因子的改变有关。     

PCV2感染猪血管内皮细胞相关免疫调节分子的表达变化

将猪圆环病毒2型(PCV2)接种猪血管内皮细胞(VEC),于接种后不同时间收集细胞及上清,利用实时荧光定量PCR和ELISA技术分析VEC相关免疫调节分子表达变化。与对照组相比,PCV2感染后血管内皮生长因子(VEGF)、IL-6与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的mRNA水平变化趋势基本一致,VEGF和M-CSF在感染后12h显著上调,IL-6与M-CSF在48h显著下调;MCP-1和IL-8在感染后4h和48h均显著上调,且IL-8在24h时上调显著,72h下调显著。蛋白水平上,VEGF在4h显著下降,24h显著增高;IL-8在4h和24h显著上升。以上结果表明,PCV2体外感染导致VEC免疫调节功能分子表达异常,其炎性趋化、黏附能力以及对树突状细胞(DC)的分化、成熟等免疫调节功能可能受到影响。     

大肠杆菌感染后家蝇幼虫血细胞中ACP和POD活性的变化

[目的]了解酸性磷酸酶（ACP）和过氧化物酶（POD）在家蝇（Musca domestica）幼虫血细胞中的定位以及大肠杆菌（Escherichia coli）对血细胞中ACP、POD活性的影响。[方法]采用酶细胞化学技术测定感染前后家蝇幼虫血细胞中ACP、POD活性,用显微摄影及定量图像法进行观察。[结果]感染后浆血胞和粒血胞中ACP、POD的活性均较正常组极显著增加（P〈0.01）。感染前后原血胞、珠血胞、类绛血胞中均未见ACP、POD的阳性反应物。[结论]感染后浆血胞和粒血胞中ACP、POD的活性增强,提示浆血胞和粒血胞是家蝇幼虫参与免疫反应的主要细胞类型,而原血胞、珠血胞及类绛血胞不参与细胞免疫反应。     

应用白僵菌防治靖远松叶蜂的研究

利用病原菌防治害虫是森林可持续发展的重要途径。本研究采用2003年4月从山西省灵丘县下关林区油松林内采集的越冬油松毛虫DendrolimustabulaeformisTsaietLiu幼虫的僵虫尸,经实验室分离、培养和鉴定后得到的白僵菌Beauveriabassiana菌株,用2×108孢子/mL、2×107孢子/mL和2×106孢子/mL3种浓度的孢子液对靖远松叶蜂DiprionjingyuanensisXiaoetZhang幼虫分别进行室内和林间感染,试验结果显示:室内感染4龄幼虫校正致死率分别为83.37%、78.82%、62.05%,LT50分别为5.794d、6.237d、7.603d;感染5龄幼虫校正死亡率分别为68.23%、59.1%、45.79%,LT50分别为7.244d、8.414d、12.274d;林间感染幼虫校正死亡率分别为65.26%、54.21%、38.23%,LT50分别为16.788d、19.187d、30.2d。结果表明靖远松叶蜂幼虫校正死亡率与白僵菌孢子液浓度呈正相关,与LT50呈负相关,与龄期呈负相关。     

猪2型圆环病毒核酸疫苗免疫效应研究

PCR扩增PCV2 ORF2和BVP22基因。将ORF2基因克隆入真核表达载体pCDNA3．1（＋），构建了pCORF2作为核酸疫苗免疫小白鼠。同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游，使二者融合表达，命名为pCORF2BVP22和pCBVP220RF2。分4组肌肉免疫BALB/c小白鼠，分别注射pCDNA3．1（＋）、pCORF2、pCORF2BVP22和pCBVP220RF2，共免疫2次，间隔2周，分别于首免后2周和二免后4周采血，ELISA法检测体液抗体。同时为在体外验证ORF2和BVP22基因的真核表达，将ORF2和BVP22基因分别克隆入pEGFP-N1载体，构建了pNORF2和pNBVP22，转染Hela细胞后在荧光显微镜下观察到了ORF2和BVP22在体外的瞬时高效表达。结果显示，通过两次免疫后，各疫苗组均产生了针对ORF2的体液抗体，同时证明BVP22可增强核酸疫苗的免疫效果，其中以BVP22在ORF2上游效果更好。本研究为防制猪2型圆环病毒感染提供了较为理想的侯选疫苗。     

2019年湖南省部分地区鸡、鸭、猪源大肠杆菌耐药性调查

旨在调查2019年湖南省部分地区不同来源的大肠杆菌对抗生素的耐药水平,为养殖合理用药提供参考。从4个市畜禽养殖场采集猪、鸡和鸭粪便285份,使用麦康凯琼脂培养基和伊红美蓝培养基对大肠杆菌筛选,利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行鉴定,采用微量肉汤稀释法检测16种抗生素对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)。共分离出203株大肠杆菌(鸡源146株、鸭源20株和猪源37株),对四环素和氨苄西林耐药率最高,分别达到89.2%和84.7%;对头孢他啶、奥格门丁、黏菌素耐药率较低,分别为2.5%、2.0%和0.5%;所有菌株均对美罗培南敏感。抗3种及以上抗生素的菌株数目占比为87.7%,而仅5.42%的菌株对所有检测的抗生素敏感。另外,来源于减抗示范养殖场的大肠杆菌对大部分抗生素的耐药率,与来源于非减抗养殖场大肠杆菌相比未见显著差异。上述结果表明,湖南省动物源大肠杆菌的耐药水平仍处在较高水平,重视兽药使用管理并持续开展对大肠杆菌的耐药性监测十分必要。