PCV2感染性分子克隆的制备及体内外感染性试验

将猪圆环病毒2型（Type2 porcine circovirus，PCV2）JXL株cDNA插入到载体pMD18-T中，获得的pMDT-PCV转染猪肾细胞PK15细胞系，盲传4代后，利用PCV2阳性猪血清进行间接免疫荧光抗体试验（IFA），能检测到特异性荧光。将pMDT-PCV质粒DNA腹股沟淋巴结注射40日龄仔猪2头，分别接种2、3次，接种剂量500μg／次，首次注射35d心脏放血致死。在体内感染性试验期间，动物未出现明显临床症状。试验结束，病理切片结果显示，不同淋巴组织中分别存在淋巴细胞缺失或增多的现象；肾小球、扁桃体、空肠淋巴结和股前淋巴结等冰冻组织切片中存在大量PCV2病毒抗原；血清中PCV2特异性的ELISA抗体效价迭1：2560，IFA效价为1：1280；通过聚合酶链式反应（PCR）可以分别从体外感染PK15细胞和体内感染动物及同圈饲养的空白对照猪的淋巴组织中扩增到病毒特异性基因片段。本研究证明含有单拷贝PCV2的重组质粒pMDT—PCV在体内、外均具有感染性，能衍生出病毒，并产生符合自然感染PCV2的大体病变和组织病理学变化，并激发较强的体液免癌应答。     

Single nucleotide polymorphism identification, linkage and radiation hybrid mapping of the porcine pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor gene to chromosome 18

Pituitary adenylate cyclase‐activating polypeptide (PACAP) is a neuropeptide with diverse biological actions. Type I PACAP receptors (PACAPR) are specific for PACAP, whereas type II and III PACAPRs are less restricted. To localize and analyse the variation of this gene, a 559‐bp long intronic fragment of the porcine PACAPR gene was amplified by polymerase chain reaction and sequenced in samples from five different pig breeds. One single nucleotide polymorphism was identified and its allele frequency was determined in all five breeds. Linkage analysis in a Berkshire × Yorkshire reference family placed the PACAPR gene on chromosome 18, between SW787 and S0062 (SW787– 8.1 cM –PACAPR– 3.0 cM –S0062). Radiation hybrid mapping confirmed that the PACAPR gene was linked to SW1682 on chromosome 18 (28.8 cR₃₀₀₀; LOD = 10.4).     

序贯培养法对猪孤雌激活胚胎发育能力的影响

经体外成熟、孤雌激活和培养获得猪胚胎,研究了不同培养体系、共培养体细胞和序贯培养对猪孤雌激活胚胎发育的影响。试验表明:孤雌激活卵母细胞在SOF 10?S培养体系中分裂效果最好,添加胎牛血清的NCSU-23和颗粒细胞对胚胎发育有促进作用,培养6d后发育到桑囊胚的比率增加(P<0.05)。在序贯培养的前3d,SOF培养基(不含葡萄糖)和颗粒细胞对胚胎的发育有促进作用,分裂率(P<0.05)和突破4细胞阻滞的数目显著增加,在培养的后3d,添加胎牛血清的NCSU-23和输卵管上皮细胞能支持较多胚胎发育到桑囊胚,桑囊胚的发育率为(59.5±3.2)%(P<0.05)。结果表明,SOF培养基和颗粒细胞 添加胎牛血清的NCSU-23和输卵管上皮细胞的序贯培养系统能较好的促进胚胎的发育。     

不同方式制备的猪胃消化液对培养猪多杀性巴氏杆菌（EO630株）的影响

在猪多杀性巴氏杆菌(EO630株)的菌液生产中,使用不同方式制备的猪胃消化液马丁汤培养基生产猪多杀性巴氏杆菌菌液,菌液菌数差异明显。结果表明用温室消化的猪胃消化液制备的马丁汤培养基有利于提高培养菌数。     

A群猪轮状病毒JS株vp7基因序列分析

根据已发表的猪轮状病毒OSU毒株vp7基因核苷酸序列ORF两端保守区序列,设计一对特异引物,以猪轮状病毒JS毒株反转录cDNA为模板,通过PCR方法扩增出长约1000 bp目的片段。将其进行T-A克隆、序列测定和分析。结果表明,vp7基因全长1062 bp,含有一个981 bp的开放阅读框,编码326个氨基酸。与已知的15个毒株vp7全长基因的核苷酸及推导的氨基酸序列比较,同源性分别为74.5%～78.5%和75.2%～83.1%,核苷酸系统发育进化树结果表明,JS毒株与轮状病毒G9型参考毒株ICB2185、O-1亲缘关系较近,分为一个群,表明JS毒株血清型为G9型。目前,我国尚未见猪及其它动物轮状病毒G9型流行株的报道。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染对猪肺泡巨噬细胞外源性抗原加工递呈相关分子和共刺激分子的影响

采用定量竞争PCR技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染后不同时相猪肺泡巨噬细胞（PAM）中外源性抗原加工递呈相关分子SLA-DR、Ii链和SLA-DM分子及共刺激分子CD40、CD80、CD86的mRNA转录动态进行了定量检测。结果表明,PRRSV感染后PAM的SLA-DR mRNA转录水平在3、7和14 d下调,低于对照组;感染后3 d,Ii链、SLA-DM和CD40的mRNA转录水平极显著下调（P〈0.01）;CD80和CD86mRNA转录水平也在感染后3 d明显下调（P〈0.05）。用流式细胞术检测PAM表面的SLA-DR抗原的结果表明,在感染后3 d短暂上升,7 d之后一直低于对照组。由此说明,PRRSV感染早期对猪肺泡巨噬细胞的外源性抗原加工和递呈功能产生显著影响,导致其外源性抗原递呈功能下降,进而影响机体的体液免疫应答。     

Analyses of monoclonal antibodies reacting with porcine wCD6: Results from the Second International Swine CD workshop

Among the 57 monoclonal antibodies analyzed within the T-cell group of the Second International Swine CD Workshop, one mAb fell within cluster T14a that included the CD6 standard a38b2 (No. 175). The new mAb MIL8 (No. 082) and a38b2 both precipitated from activated T-cells a 150 kDa monomeric protein. Staining patterns on the various cell types were similar. There was no inhibition of binding of either mAb to peripheral blood T-cells with the opposite mAb. The new mAb, MIL8, reacts with a separate epitope on porcine wCD6.     

抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的研制及其特性鉴定

以新生乳猪增殖猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）,通过蔗糖密度梯度离心将其纯化,获得较为完整的病毒颗粒。病毒ＥＬＩＳＡ效价为１∶３×１０５,蛋白含量为３．９６ｇ／Ｌ。将提纯的ＰＥＤＶ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,取免疫鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合,融合率为９５．６％。用间接ＥＬＩＳＡ进行筛选,共检出３８个阳性孔,阳性率为２８．８％。对其中１５个阳性值较高的孔进行３次再克隆,阳性率达１００％,最后获得１５株稳定分泌特异性抗ＰＥＤＶ单抗（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞。ＥＬＩＳＡ阻断试验与交叉试验证明,其分泌的抗体具有高度特异性。腹水和细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ效价分别为１∶１０３～１∶１０６和１∶１２８～１∶５１２。经鉴定,１５株ＭｃＡｂ的分子类型均为ＩｇＧ,均无免疫沉淀特性。杂交瘤细胞的染色体数目为９０～１１０,平均９５。尤为重要的是,这些杂交瘤细胞所分泌的抗体,有的对ＰＥＤＶ具有中和作用,能够阻断病毒对猪只的侵害作用。     

仔猪暴发猪繁殖与呼吸道综合征

调查了１９９５年广东省３个猪场暴发的疫病,根据流行病学、临床症状、病理变化、人工感染试验,结合间接免疫荧光试验及电镜观察等实验室诊断,确诊为猪繁殖与呼吸道综合征。     

人工感染猪流行性腹泻病毒仔猪外周血SmIg+B细胞及T细胞的动态观察

本实验对猪流行性腹泻病毒(PEDV)—J毒株细胞培养毒接种的6头仔猪和3头健康仔猪外周血SmIg~+B细胞及T淋巴细胞的数量作了检测。T细胞用总E玫瑰花(Et)及活化E玫瑰花(Ea)试验作检测,SmIg~+B细胞用荧光素标记的葡萄球菌A蛋白(FITC—SPA)菌体法鉴定。结果:接种后,SmIg~+B细胞百分率显著上升,于第23天时达峰值(29.19±3.45),明显高于对照猪(P<0.05),Et玫瑰花百分率虽略有上升,但与接种前相比无统计学差异(P>0.05),而Ea玫瑰花百分率则显著低于接种前水平(P<0.01)。以上结果表明,PEDV—J毒株细胞培养毒可刺激仔猪B细胞明显增多。由此认为,B淋巴细胞积极参与PED的免疫反应过程,体液免疫是PED猪的主要免疫反应。