高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株及其致弱过程中的不同代次病毒的分子特征分析

为了追踪高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syn-drome virus,HP-PRRSV）毒力逐渐减弱的分子轨迹,我们以HP-PRRSV亲本毒HuN4株及其系列传代致弱毒株为研究对象,对HuN4株及其不同代次毒株其全基因序列进行了序列比较分析。结果显示由高致病性的亲本毒HuN4株到无致病性的F112代的疫苗毒,共有65个核苷酸发生突变,其中导致41个氨基酸发生突变,这些突变的氨基酸分散性的存在于不同基因区域。与已经报道的高致病性JXA1株及其致弱毒株JXA80株相比较,可以看到两个强毒株毒力致弱的演变轨迹并不完全相同,二者之间不仅氨基酸突变数量不一致,而且突变氨基酸的位置也不完全相同,但其共同特点是由强毒株到弱毒株的变化过程中,突变率较高的结构蛋白相一致,突变率较高的非结构蛋白基本一致。分析结果提示我们决定高HP-PRRSV毒力强弱的因素可能不是由单个氨基酸的突变来决定的,推测是由一个基因或多个基因或多种因素共同造成的,同时也使我们认识到PRRSV的非结构蛋白区在病毒毒力变化中可能发挥重要作用。     

猪肌肉卫星细胞的分离培养及生物学特性鉴定

以猪胎儿为材料,采用胶原酶消化法或组织块法培养胎儿背部最长肌获得了肌肉卫星细胞,该细胞体外可以传到9代以上。培养的细胞多呈纺锤体型和梭型,具有明显的方向性,呈典型的长轴平行排列。流式细胞仪分析结果显示,该细胞呈CD29、CD166、CD45、CD44阳性,CD71、CD34阴性。RT-PCR检测发现其表达Desmin、C-Myc、Nanog、Pcna、Oct4、Klf4,弱表达Myog,不表达Sox2、MyoD。免疫组化染色发现其表达Desmin等肌肉细胞的特异性标记,同时表达Nanog、Pcna等多能性细胞标记。本试验建立了一种简便高效的猪肌肉卫星细胞体外分离和培养方法,得到的细胞具有肌肉卫星细胞的典型生物学特性,同时表达间质干细胞和多能性干细胞的部分标记。     

规模猪场PRRS风险因素分析

猪繁殖与呼吸综合征造成养猪产业巨大经济损失,预防和消除该病已成为世界性难题。本文根据猪繁殖与呼吸综合征流行病学特性,结合规模化猪场生产管理实际,采用风险列举法对规模猪场PRRS传入和场内传播流行的风险因素进行了系统分析。提出规模猪场PRRS风险因素主要包括猪场选址、用品和工具进入、员工和访客进入、活猪运输、饲料运输、死猪处理、粪便管理、猪舍条件、生物传播媒介、引种等外部风险因素和PRRSV状态、管理措施、猪只流动、设施条件、协同病原、猪舍布局等内部风险因素。这为进一步开展规模猪场PRRS风险评估研究,制订科学有效的PRRS风险管理措施奠定了良好基础。     

PRRSV辽宁分离株ORF3基因的克隆与序列分析

以辽宁地区某猪场猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病料为材料,采用RT-PCR方法特异性扩增编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白的ORF3基因全长cDNA,结果该分离株ORF3基因cDNA编码区长765bp,可编码254个氨基酸残基,与美洲型代表株VR-2332和欧洲型代表株LV进行同源性比较,氨基酸同源性分别为87.8%和54.5%,因此推测辽宁分离株属于美洲型。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

参照GenBank收录的猪圆环病毒2型(PCV2)基因组全序列选择保守区域设计合成了引物及其探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqM an荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床采集的组织病料进行了检测,并与常规PCR检测方法作比较.结果显示,所建立的方法灵敏度可达3×101拷贝.μL-1,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)没有交叉反应,具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点,适合于PCV2的流行病学调查和临床诊断.     

猪卵母细胞室温保存与成熟培养

猪卵母细胞在TCM—199培养基中,20℃和37℃(对照)下,分别培养24h和48h。培养基中加入20%混合的3个犊牛血清、5%的猪卵泡液。气体浓度为90%N_2,5.2%O_2和4.8%CO_2。24h,20℃和37℃培养的卵母细胞经台盘蓝鉴别后,存活率分别为71%和69%。当培养到48h,20℃组的成活率明显高于37℃组,分别为61%和25%。电镜观察,20℃组卵母细胞的线粒体较完整,微绒毛较多。而37℃组则相反。当20℃培养24h 后,把卵母细胞移到37℃下继续培养24h,仍有45%的存活率,11%的颗粒细胞扩散程度较好。染色后,可见第1极体和染色体,说明处于第2次成熟分裂的中期。实验说明,20℃保存24h 仍有继续发育成熟的潜力。     

Enhancing effects of serum-rich and cytokine-supplemented culture conditions on developing blastocysts and deriving porcine parthenogenetic embryonic stem cells

The present study was conducted to develop an effective method for establishment of porcine parthenogenetic embryonic stem cells (ppESCs) from parthenogenetically activated oocyte-derived blastocysts. The addition of 10% fetal bovine serum (FBS) to the medium on the 3rd day of oocyte culturing improved the development of blastocysts, attachment of inner cell masses (ICMs) onto feeder cells, and formation of primitive ppESC colonies. ICM attachment was further enhanced by basic fibroblast growth factor, stem cell factor, and leukemia inhibitory factor. From these attached ICMs, seven ppESC lines were established. ppESC pluripotency was verified by strong enzymatic alkaline phosphatase activity and the expression of pluripotent markers OCT3/4, Nanog, and SSEA4. Moreover, the ppESCs were induced to form an embryoid body and teratoma. Differentiation into three germ layers (ectoderm, mesoderm, and endoderm) was confirmed by the expression of specific markers for the layers and histological analysis. In conclusion, data from the present study suggested that our modified culture conditions using FBS and cytokines are highly useful for improving the generation of pluripotent ppESCs.     

黑龙江省东部地区猪蓝耳病流行检测分析

为了解黑龙江省东部地区猪蓝耳病(PRRS)的流行情况,从黑龙江省东部地区的牡丹江市、宁安市、海林市、绥芬河市、鸡西市、鸡东市、佳木斯市、密山市、虎林等地,共采集猪血清样本663份。采样猪群包括公猪、母猪、仔猪、育肥猪。采集的猪场包括规模化猪场、小规模的猪场及散养户。应用ELISA方法对该省东部地区猪蓝耳病的流行情况进行血清学调查,结果显示:663份血清中,其中,134头为阳性,阳性率为20.21%;529头为阴性,阴性率为79.79%;S/P值大于2.0的26头,占总阳性比率的19.40%。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因重组DNA疫苗的构建及其免疫效果评价

【目的】利用DNA改组技术（DNA shuffling）对不同谱系的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF5基因进行体外重组,构建具有良好交叉保护作用的DNA疫苗,为研制新型PRRSV疫苗提供参考。【方法】利用DNA改组技术对PRRSV谱系1、3、5.1、8.7毒株的ORF5基因进行体外突变重组,筛选去除信号肽的重组突变体。将重组突变体与真核表达载体pCAGGS-HA连接,构建重组表达质粒并进行酶切和测序鉴定,经脂质体转染MARC-145细胞,利用间接免疫荧光试验（IFA）和Western blotting试验检测目的蛋白的表达情况。将重组质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46（ORF5基因重组的DNA疫苗）免疫小鼠,试验同时设pCAGGS-HA空载体组、PBS空白对照组、弱毒疫苗组（经典弱毒疫苗Ingelvac PRRS MLV,MLV组）和pCA-ORF5-MLV组（ORF5基因来自Ingelvac PRRS MLV）,评估其免疫效果。【结果】筛选到2个去除信号肽的重组突变体（ΔORF5-8和ΔORF5-46）。成功构建重组表达质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46,其可在MARC-145细胞中表达GP5蛋白。与pCAGGS-HA空载体组和PBS空白对照组相比,pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46组免疫小鼠血清白介素4（IL-4）和干扰素γ（INF-γ）含量均极显著提高（ORF5＜0.01）,脾淋巴细胞增殖能力均极显著增强（ORF5＜0.01）,均能产生针对GP5蛋白的抗体,血清中和试验表明,免疫组小鼠血清能对异源毒株产生交叉中和抗体（抗体平均滴度为10～16）。【结论】重组DNA疫苗pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46均能有效刺激并诱导机体产生细胞及体液免疫应答,具有良好的免疫原性。