猪卵母细胞在GV期与MⅡ期的冷冻保存效果比较研究

为比较猪卵母细胞在GV期与MⅡ期的冷冻保存效果,试验在这两个成熟阶段对其进行玻璃化冷冻,GV期卵母细胞解冻后培养至成熟,MⅡ期卵母细胞解冻后恢复2 h,然后采用免疫荧光标记、Western blotting和链霉蛋白酶溶解方法分别检测它们的皮质颗粒分布、CD9蛋白表达水平和透明带消化时间上的差异。结果表明,GV期卵母细胞在解冻后2 h的存活率显著低于MⅡ期卵母细胞（P<0.05）,但极体排出率与对照卵母细胞无明显差异（P>0.05）;在冷冻MⅡ期卵母细胞中,皮质颗粒的皮质区分布比例和CD9的蛋白表达水平显著下降（P<0.05）,但冷冻GV期卵母细胞经体外成熟后则无明显变化（P>0.05）;冷冻GV期与MⅡ期卵母细胞均不会影响透明带的消化时间（P>0.05）。由此可见,猪卵母细胞在GV期的冷冻存活率虽然较MⅡ期低,但其体外成熟后极体排出率、皮质颗粒分布和CD9蛋白表达水平均未受到冷冻的影响。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析

为了弄清2006年在我国南方一些猪场暴发的一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染病的病因,我们从12个省市48个发病猪场采集临床样品进行了猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的分离鉴定和分子流行病学分析。结果显示从48个猪场样品中均检测出了PRRSV,通过完整的ORF5和部分Nsp2基因序列比较分析发现来自12个省市不同猪场的PRRSV高度同源,而且在Nsp2基因上都有两个相同位点的缺失;从分离的15株PRRSV中选择湖南分离株HuN4人工感染5头60日龄的健康猪,结果5头猪分别在7 d～21 d内全部死亡,感染猪的临床症状和现地所见十分相似。本次试验结果表明新出现的以Nsp2基因部分缺失为特征的PRRSV对猪是高致病性的,可能是2006年大部分猪场暴发"高热综合症"的主要病因。     

猪轮状病毒四川株的分离鉴定及增殖规律

为了解猪轮状病毒（PoRV）在MARC-145细胞系上的培养特性及增殖规律,本试验利用MARC-145细胞,从四川仔猪腹泻样品中分离到1株PoRV,并通过PCR检测、病毒理化实验与微量中和实验证实,命名为SC-R株。用含不同浓度胰酶营养液培养SC-R株48h后,分别收集病毒液进行定量分析;同时,以SC-R分离株感染MARC-145细胞,在感染后不同时间分别收集感染病毒液,利用PoRV荧光定量检测方法对不同样品中病毒RNA进行定量分析,绘制PoRV生长曲线。结果表明,用含3％胰酶营养液培养的细胞液中PoRV的RNA含量明显高于其他组;-步生长曲线显示细胞外病毒RNA含量呈“s型”曲线增长,感染后0～8h为潜伏期,病毒RNA含量维持在较低水平;8～36h为突破期,病毒RNA含量呈对数增长;感染48h增长速度减缓,维持在较高水平,逐步进入稳定期。胰酶可增加PoRV对细胞的感染性,3％是本试验最为适用的胰酶浓度;PoRV感染MARC-145后在细胞内增殖并逐步释到细胞外。     

猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用

本研究利用原核表达的猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白作为标准抗原蛋白建立PCV2抗体检测方法,同时对建立的检测方法的相关条件进行了优化。通过优化确定抗原的最佳包被浓度为10 μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶160,最佳封闭试剂为10%牛血清,二抗的使用浓度为1∶1000,血清及二抗的最佳反应条件为37 ℃孵育60 min,底物的最佳反应条件为37 ℃反应10 min,cutoff值为0.25。通过批内及批间重复性的评价,变异系数均小于0.1,表明本检测方法具有较高的可重复性。与标准的检测试剂盒相比,检测临床样本时,本检测方法与对照试剂盒检测结果符合率为91.7%。结果表明,建立的检测方法可用于临床PCV2抗体的检测。     

不同毒力猪繁殖与呼吸综合征病毒对仔猪肺和外周免疫器官损伤的研究

为研究不同毒力的PRRSV对仔猪肺脏和外周免疫器官损伤的差异,本实验分别采用PRRSV变异株(HuN4株)和PRRSV经典株(CH-1a株)感染35日龄健康的断奶仔猪,并在感染后0 d、3 d、7 d、10 d和14 d各迫杀3头,检测肺、颌下淋巴结、肠系淋巴结、腹股沟淋巴结、扁桃体和脾脏的病毒载量及病理变化情况,同时检测血清中抗PRRSV的抗体水平。结果表明:感染后3 d肺脏及各免疫器官可检测到病毒,HuN4感染组病毒载量比CH-1a感染组病毒载量高1 000倍;HuN4感染组病毒载量峰值出现在感染后10 d,而CH-1a感染组维持着较低水平的病毒载量。组织病理学检测显示HuN4感染组淋巴结内淋巴细胞显著减少,呈空泡状;CH-1a感染组淋巴结内淋巴细胞轻度减少,呈星隙状。本实验表明HuN4株比CH-1a株对肺和外周免疫器官造成更严重的损伤。     

猪瘟病毒E2蛋白与猪RACK1相互作用的鉴定

为筛选和鉴定与猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白相互作用的猪宿主蛋白,我们采用酵母双杂交方法筛选猪肺泡巨噬细胞表达文库得到与CSFV E2蛋白相互作用的宿主细胞RACK1蛋白,经共转化试验和GST pull-down试验进一步证实两者可以特异性结合,并且共聚焦试验表明两者共定位于细胞的细胞浆。本研究显示E2蛋白与宿主细胞RACK1蛋白存在相互作用,RACK1在CSFV感染过程中所发挥的功能有待进一步研究。     

影响猪精子介导基因转移效果的因素研究

为优化猪精子载体法技术参数,利用荧光定量PCR、荧光显微镜检测和精液常规检测方法,分析不同DNA转染剂、不同孵育温度和不同形态DNA对猪精子转染外源DNA的影响。结果表明,PEI和TransFast转染剂能极显著提高猪精子转染效果,且PEI优于TransFast,而NanoFect转染剂包裹DNA不能转染精子。随着转染温度的升高,精子的活力和活率均明显下降,而转染率和内化外源DNA量基本保持稳定,而吸附外源DNA量呈下降趋势。环状DNA和线性化DNA在与精子共孵育后,两者的精子活力、活率、转染率和内化外源DNA量差异均不显著,精子吸附线性化DNA量极显著高于环状DNA量。综合分析表明,外源DNA形态对猪精子转染效果无显著影响;PEI和TransFast能够显著提高猪精子转染效果;共孵育温度以17℃为最佳,本结果为开展精子载体法制备转基因猪研究提供了基础试验依据。     

稀释液成分对猪精液碱性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影响

以猪精液稀释液主要成分为效应物,研究其对杜洛克猪精液中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶Ⅱ活力的影响。结果表明：在一定浓度下青霉素钾和硫酸链霉素对酶活力没有影响;EDTA·2Na和维生索C对酶活力有显著的激活作用;葡萄糖和蔗糖对酶活力有先扬后抑的作用;果糖、柠檬酸三钠、三羟甲基氨基甲烷、碳酸氢钠对酶活力则有不同程度的抑制作用;三羟甲基氨基甲烷表现为可逆的非竞争性抑制,抑制常数K1为9．81mmol／L;碳酸氢钠则表现为可逆的混合型抑制,抑制常数K_I和K_ID分别为111．18mmol／L和26．61mmol／L。