骨骼肌电穿孔转基因技术研究进展

目前,在大动物模型试验中,骨骼肌电穿孔转基因技术已被广泛用于转染一些功能基因,并能显著提高非病毒载体基因的转染效率。笔者就电穿孔促进基因通过细胞膜的可能机理及影响骨骼肌电穿孔转基因效率的关键因素（如物种、细胞直径、场强、脉冲参数、电极和电脉冲仪等）进行了综述。     

大肠杆菌耐药基因定位及耐药质粒消除

对采集的9株野生型大肠杆菌在药敏试验的基础上,进行了耐药基因定位。结果表明,4个菌株的氨苄青霉素耐药基因位于质粒上,不同畜群来源菌株之间耐氨苄青霉素质粒存在差异。用中草药艾叶的乙醇提取物和蒸馏提取物对大肠杆菌庆大霉素耐药性及耐药质粒进行了消除试验,结果艾叶乙醇提取物的消除率最高可达69.4%。     

发根农杆菌诱导毛状根研究进展

检索国内外相关文献,从发根农杆菌的性质、其中含有的Ri质粒、发根农杆菌诱导植物形成毛状根的机制、诱导植物产生毛状根的特点、毛状根的转化方法及鉴定和毛状根的应用等方面进行综述,为其广泛深入研究提供参考。     

猪流产嗜性衣原体omp-1基因的重组质粒与重组蛋白免疫组合效果

为增强猪流产嗜性衣原体omp-1基因的免疫措施进而筛选出高效新型分子疫苗,本实验将猪流产嗜性衣原体omp-1基因克隆入pcDNA3.1( )载体构建DNA疫苗,初次和二次免疫分别以核酸/重组蛋白(DNA/r-MOMP)、重组蛋白/核酸(r-MOMP/DNA)、重组蛋白 核酸/重组蛋白 核酸(r-MOMP DNA/r-MOMP DNA)、核酸 核酸(DNA/DNA)和重组蛋白 重组蛋白(r-MOMP/r-MOMP)5种组合接种BALB/c小鼠,同时以载体和弱毒为对照。二次免疫后14 d以ELISA和T淋巴细胞增殖实验检测特异性体液免疫和细胞免疫应答水平。结果显示核酸与重组蛋白同时免疫可以诱导产生较高的体液免疫和细胞免疫水平,而DNA/r-MOMP组合的细胞免疫和体液免疫水平高于r-MOMP/DNA组合,单独免疫DNA组或r-MOMP都不能获得好的细胞和体液免疫。     

蓝舌病病毒衣壳蛋白VP2、VP5、VP7酵母双杂交诱饵质粒的构建及鉴定

蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)的结构主要由3层衣壳蛋白组成,其中VP2、VP5蛋白构成了BTV的外层衣壳,VP7蛋白构成了BTV的中间衣壳,最内层衣壳则由VP3蛋白构成。VP2、VP5及VP7蛋白在BTV侵染宿主细胞的过程中起着非常重要的作用。为了研究BTV与宿主细胞相互作用的分子机制,本研究将BTV的VP 2、VP 5、VP 7基因分别克隆到pGBKT7载体中,成功构建了pGBKT7-VP2、pGBKT7-VP5与pGBKT7-VP73个诱饵质粒,且通过自激活和毒性验证,证明所构建的3个质粒均无自激活作用,对酵母细胞无毒性作用。本研究为今后利用酵母双杂交筛选VP2、VP5、VP7蛋白中与宿主细胞相互作用的蛋白做好了铺垫,为深入研究BTV与宿主细胞的相互作用奠定了基础。     

Inhibitory effects of interleukin-10 plasmid DNA on the development of atopic dermatitis-like skin lesions in NC/Nga mice

Interleukin (IL)-10 exerts potent anti-inflammatory effects by suppression of both T-help (Th) 1 and Th2 cells. Previous studies have reported that IL-10 can ameliorate various inflammatory disorders. The present study was performed to examine whether IL-10 plasmid DNA could suppress development of atopic dermatitis (AD)-like skin lesions in NC/Nga mice, as an initial step towards the development of an appliance for use in dogs with AD. Intradermal injection of IL-10 plasmid DNA markedly inhibited the development of AD-like skin lesions, as evidenced by a marked decrease in skin symptoms and reduced inflammation within the skin lesions. Efficacy was confirmed by significant decreases in eosinophil ratio and serum IgE concentration, and a reduction in the number of Staphylococcus aureus recovered from the ear. Moreover, relative mRNA expression levels of IL-4 and interferon-γ in the skin lesions of mice injected with IL-10 plasmid DNA were also decreased compared with those of control mice. Of note, higher serum IL-10 levels in mice injected with IL-10 plasmid DNA were maintained compared with those in control mice. Taken together, the results indicate that IL-10 plasmid DNA can suppress the development of AD-like skin lesions by suppressing both Th1 and Th2 cell responses. Beneficial effects of IL-10 plasmid DNA may be expected in dogs with AD.     

地衣芽胞杆菌HS10原生质电转化体系的研究

地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis HS10及其粗蛋白对多种病原真菌具有防治效果,为挖掘其生防功能基因,本研究通过对原生质体的制备、再生培养基、渗透压稳定剂、电击参数等试验条件进行优化,建立了地衣芽胞杆菌HS10原生质体电转化法。结果表明最佳转化条件为:转接培养10h达到对数生长后期的菌体,浓缩4倍后,利用终浓度1mg/mL的溶菌酶,于37℃、150r/min酶解20min,酶解效率达到99.34%,1×SMM洗涤3次,调整菌浓度至1.0×108 cfu/mL,并通过1.6kV、5ms的电击后,迅速在SMMP溶液中100r/min、37℃恢复6~10h,涂布于含Kan和Erm的再生培养基DM3平板。将该方法用于突变体库构建的质粒pMarA(8 253bp)和基因敲除质粒pMADΔCP(13 043bp)的大片段质粒转化,分别获得了37cfu/μg DNA和10cfu/μg DNA阳性转化子。该遗传转化体系为地衣芽胞杆菌HS10中相关基因功能的研究提供了技术支撑。     

Generation of CRISPR/Cas9-mediated lactoferrin-targeted mice by pronuclear injection of plasmid pX330

Lactoferrin is a member of the transferrin family of multifunctional iron binding glycoproteins. While numerous physiological functions have been described for lactoferrin, the mechanisms underlying these functions are not clear. To further study the functions and mechanisms of lactoferrin, we modified the lactoferrin promoter of mice using the CRISPR/Cas9 system to reduce or eliminate lactoferrin expression. Seven mice with lactoferrin promoter mutations were obtained with an efficiency of 24% (7/29) by injecting the plasmid pX330, expressing a small guide RNA and human codon-optimized SpCas9, into fertilized eggs of mice. Plasmid integration and off-targeting of pX330 were not detected. These results confirmed that pronuclear injection of a circular plasmid is a feasible and efficient method for targeted mutagenesis in mice.     

热不对称PCR(TAIL-PCR)和Tn5转座子质粒拯救法快速分离水稻条斑病菌致病相关基因

构建植物病原菌突变体库是进行新基因发掘和功能基因组学研究的有效途径之一.为快速准确地鉴定Tn5的插入位点和相应的功能基因,研究采用热不对称PCR(TAIL-PCR)和Tn5转座子质粒拯救两种技术,鉴别了在筛选水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)Tn5插入突变体库过程中获得的8个在水稻(Oryza sativa)上毒性减弱的突变体.结果显示,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救结合使用,可有效地鉴别Tn5的插入位点和相应的功能基因.TAIL-PCR鉴别的5株突变体是Tn5分别插入在分泌系统结构蛋白F基因(gspF)、cAMP调控蛋白、膜镶嵌蛋白酶酶原、S-蛋硫氨酸脱羧酶亚基和gspJ基因上;Tn5质粒拯救法鉴别的3株突变体是Tn5分别插入在致病性蛋白、功能未知的保守蛋白和鞭毛特异性ATP合酶基因上.序列同源性分析发现,8株突变体Tn5插入的基因与基因组测序的BLS256菌株中的对应基因同一性达100%.这表明,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救技术可有效地应用于植物病原菌Tn5突变体库的鉴别和目标基因的分离.     

猪圆环病毒核酸疫苗pcDNA-PCV-ORF2-ISS的构建及分子佐剂联合免疫研究

用PCR方法扩增猪圆环病毒PCVwhn株编码CAP蛋白的基因ORF2,同时人工合成一段CpG序列,并设计上下游引物,进行扩增,定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建新型核酸疫苗(pcDNA-PCV-ORF2-ISS),并进行了酶切和测序鉴定.用构建的pcDNA-PCV-ORF2-ISS质粒以及pcDNA-PCV-ORF2与5种细胞因子分子佐剂质粒(IL-6/4、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ真核表达质粒)联合对仔猪进行免疫试验.免疫后用间接ELISA法测定猪圆环病毒Ⅱ型特异性抗体IgG,用流式细胞仪测定猪血液CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚类的数量.结果显示,成功构建含CpG免疫刺激序列的猪圆环病毒Ⅱ型核酸疫苗;pcDNA-PCV-ORF2-ISS在仔猪免疫实验能诱导细胞免疫并产生特异性抗体(P<0.05);用5种细胞因子分子佐荆质粒与pcDNA-PCV-ORF2疫苗同时免疫能显著提高DNA疫苗的免疫效果(P<0.05).分子佐剂免疫增强效果次序为:IL-6、CpG、IL-6/4、IL-2、IL-4和IFN-γ,表明IL-6和CpG最佳.