龙眼体胚发生早期miR166初级体的克隆与表达分析

为了解龙眼miR166初级体基因Pri-miR166 S53结构特点及其前体和成熟体在龙眼体胚发生早期的表达模式,采用SMART~(TM) RACE试剂盒和PCR扩增技术克隆龙眼体胚早期miR166基因的初级体(Pri-miR166 S53),确认其转录起始位点,并预测其含有的潜在ORF;利用龙眼基因组数据库提取其启动子序列,预测其含有的顺式作用元件;用实时荧光定量PCR对龙眼体胚发生早期及不同激素处理下的胚性愈伤组织中miR166基因的前体(Pre-miR166 S53)和成熟体(miR166a.2)表达模式进行分析。结果表明:获得长317 bp的Pri-miR166 S53基因初级体序列,对其进行翻译,得到一条长13个氨基酸序列的miPEP(MLCFVDALFLIST)。利用生物信息学软件分析Pri-miR166 S53基因的启动子序列发现,除了具有TATA/CAAT-box外,还含有生长素、脱落酸、乙烯、水杨酸、茉莉酸甲酯及spl、HSE等特异作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,在2,4-D调控的龙眼体胚发生早期过程中,从胚性松散型愈伤组织发育到球形胚的过程中,Pri-miR166 S53基因的前体pre-miR166 S53和成熟体miR166a.2都表现为下调趋势;而在无2,4-D调控的龙眼体胚发生早期中,pre-miR166 S53和miR166a.2表达模式不同。此外,pre-miR166S53随ABA和乙烯处理浓度升高呈下调表达,而对不同浓度2,4-D处理无应答;miR166a.2随2,4-D、ABA处理浓度升高呈下调表达,而在乙烯处理下呈上调表达。上述研究结果提示miR166前体和成熟体在对外源激素应答的模式上并不呈简单线性相关,可能存在多层次、多方位的调控。     

MdMYB73的分子克隆及其在苹果愈伤组织和拟南芥幼苗中的盐抗性功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个MYB转录因子基因(序列号:MDP0000894463)。该基因包含长为729 bp完整的开放阅读框,编码243个氨基酸,预测其蛋白质分子量为26.34 kD,等电点为9.29。系统进化树分析表明,这一MYB转录因子与拟南芥AtMYB73同源序列相似性最高,因此将其命名为MdMYB73。功能域分析表明,MdMYB73蛋白含有保守的R2R3-typeMYB绑定域。荧光定量PCR分析表明,MdMYB73在苹果的各个组织均有表达,在叶片和花中表达相对较高;MdMYB73的表达明显受盐胁迫的诱导。将异位表达MdMYB73的拟南芥幼苗进行抗盐鉴定,结果表明MdMYB73负调控拟南芥盐胁迫抗性;同时,AtSOS1,AtSOS3和AtNHX1抗盐相关基因的表达水平显著降低,表明MdMYB73可能负调控SOS反应,影响拟南芥抵抗高盐胁迫过程。将MdMYB73基因遗传转化苹果愈伤组织,抗盐表型分析表明,MdMYB73过量表达也明显降低了转基因愈伤组织对盐胁迫的抗性。     

植物脱水素对多种逆境的响应

综述了目前关于脱水素（Dehydrin,DHN）的研究进展,包括脱水素的蛋白结构特征、细胞定位及作用机制,脱水素在生物及非生物逆境下的转基因研究,脱水素的磷酸化修饰,脱水素的结合金属离子、清除活性氧、作为分子伴侣 保护酶活性等特性。展望了利用现代生物技术将脱水素用于提高植物对逆境的耐受力的应用前景,提出今后还需在脱水素作用机制、基因家族功能与生物胁迫相关性等几个方面进行深入研究。     

转hrf1基因水稻对稻曲病抗性分析

用注射接种法测定9个转hrf1基因水稻品系对稻曲病的抗性,结果表明B12-2m、B12、HTRP2和NJH12转基因系对稻曲病的抗性有显著提高,其中NJH12对稻曲病的抗性表现最突出。在江苏南京和安徽潜山两地的田间测定结果显示NJH12对稻曲病的抗性表现明显,与对照相比防效提高65%以上。用RT-PCR测定抗病转基因系中防卫基因的表达,在抗病转基因系中,Ospr1a、Ospr1b和PAL等防卫反应基因的表达明显增强。转hrf1基因水稻可能通过诱导防卫反应基因的表达提高水稻对稻曲病的抗性。     

小麦诱导抗性基因TaWIR1b的克隆及表达分析

全蚀病是小麦上一种重要的土传病害。选育和种植抗病品种是防治小麦全蚀病的根本途径,抗病基因研究是抗病育种的基础性工作。根据基因TaWIR1b(Accession no.M94959.1)的全长序列设计引物扩增‘新农19’的cDNA,获得了完整ORF,编码85个氨基酸残基,比对后发现与TaWIR1b序列同源性达100%。根据获得的TaWIR1b基因全长序列设计定量引物,分析TaWIR1b在全蚀菌胁迫条件下不同互作模式的表达特征。结果表明接种全蚀病菌后抗病小麦品种‘新农19’中TaWIR1b基因被诱导表达,接菌后3d达到峰值143.97,感病品种‘新麦19’中峰值出现在接菌后8d,表达量仅为对照的4.22倍,提示该基因可能参与小麦对全蚀病的抗病过程。     

利用双标准曲线法检测刺萼龙葵 SrDOG1基因的表达

双标准曲线法是基因表达定量研究中应用较广的一种相对定量检测方法。本研究结合绝对定量的原理,对传统双标准曲线法进行了改进。以刺萼龙葵延迟萌发基因DELAY OF GERMINATION 1(DOG1)的表达检测为例,选择β-actin为内参基因,分别将目的基因和内参基因片段插入pEASY-Blunt Zero载体,制作标准质粒。提取冷藏或常温储藏种子的RNA进行荧光扩增,同时将标准质粒梯度稀释液作为模板构建标准曲线,以此计算SrDOG1的相对表达量。结果表明,双标准曲线法能够灵敏地检测SrDOG1基因的差异表达,发现冷藏种子中SrDOG1基因的表达量较常温储藏显著增高。双标准曲线法检测结果稳定,重现性好,数据处理简单,适用于多种条件下基因表达水平的比较,为进一步系统研究刺萼龙葵DOG1基因的表达特性和基因功能奠定了基础。     

小菜蛾γ- 氨基丁酸受体基因片段的克隆、表达及特征分析

 利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR) 对小菜蛾( Plutella xylostella ) 的γ - 氨基丁酸a(GABAa) 受体基因cDNA片段进行了克隆和序列分析。通过简并性上游引物和下游引物扩增出小菜蛾GABAa受体基因248 bp的cDNA片段。该cDNA基因片段的氨基酸与已报道的烟芽夜蛾(Heliothis viresce)的GABAa受体基因氨基酸序列同源性为100%。以GABAa受体基因片段为基础, 构建了优化的半定量RT-PCR法, 以18S rRNA为内标, 研究小菜蛾不同组织以及不同发育阶段GABAa受体基因表达的差异。结果表明, GABAa受体基因在头部表达量最高, 胸部次之, 腹部最低; 在不同发育阶段的表达量差异不大。     

辣椒CaCOI1 基因的克隆、表达及其序列分析

 利用RT-PCR技术从辣椒中克隆到基因CaCOI1,该基因编码的蛋白质由603个氨基酸残基组成,蛋白质的分子量为68.35 kD,等电点是6.32。在蛋白质N–端有1个F-box结构域,C–端有6个富含亮氨酸结构域。二级结构分析表明,CaCOI1蛋白分子中,α–螺旋、β–折叠、β–转角和不规则卷曲分别为51.41%、13.76%、5.80%和29.03%。CaCOI1蛋白的平均亲水系数为–0.143,为亲水蛋白。蛋白质序列比对和进化树分析表明,CaCOI1与番茄LeCOI1蛋白的一致性最高（94%）,进化距离最近。实时定量RT-PCR分析表明,CaCOI1在辣椒的根、茎、幼叶、成熟叶、花、青熟期果实、成熟红果等不同生长发育时期的组织中都能表达,在花中表达水平最高,是其他组织的2.8 ~ 5.4倍,表明CaCOI1在花的发育过程中起重要作用。     

石斛兰dfr基因的克隆、序列分析及原核表达

二氢黄酮醇4 - 还原酶(DFR) 在不同花色形成中起着关键作用。利用RT-PCR方法从石斛兰中克隆出dfr基因, 并命名为Dendfr。该序列全长1 164 bp, 编码352个氨基酸。氨基酸序列分析发现, DenDFR与3种兰科植物的DFR氨基酸序列同源性达81% ～86% , 与其他非兰科植物的DFR氨基酸同源性在56% ～72%之间。在Den DFR N - 末端存在一个保守的NADP结合区, 序列中存在26个氨基酸组成的底物特异结合区, 其中134位氨基酸处存在特异的天冬酰胺N位点。将Dendfr的编码区克隆到pQE30载体中, 在大肠杆菌中高效表达了该蛋白, 为进一步研究石斛兰花色形成机制及花色改良基因工程打下基础。     

套袋对‘茌梨’果实蔗糖代谢及相关酶基因表达的影响

 研究了4种材质的果袋套袋处理对‘茌梨’（Pyrus bretschneideri Rehd.‘Chili’）果实生长发育过程中可溶性糖含量及蔗糖代谢的影响。结果表明,果实中的果糖、葡萄糖、蔗糖及可溶性总糖含量均随着果实的发育进程而增加;不同材质果袋影响糖增加的程度不同,套黄蜡纸袋的糖增加最少;转化酶（Ivr）活性随着果实的发育而降低,套袋降低了花后75 ~ 90 d 和花后150 d 果实酸性转化酶（AI）活性,而对中性转化酶（NI）影响不明显;蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性随着果实的发育而增加,套袋处理不同程度上降低了SPS活性,以套黄蜡纸袋最为明显,其次是套白蜡纸袋和无纺布袋,套塑料膜袋的大部分测试点与对照差异不显著;随着果实的发育,果实中蔗糖合成酶合成活性（SSs）逐渐增加,蔗糖合成酶分解活性（SSc）逐渐下降,套袋对SSs活性影响在多数测定点差异不显著,但降低了果实发育后期SSc活性。蔗糖代谢相关酶基因AIV1、AIV2、SPS1和SUS1表达的实时荧光定量PCR分析表明,套袋降低了AIV2的相对表达量,降低程度套无纺布袋大于套塑料膜袋;推迟了果实中SPS1的相对表达量最大值出现的时间,套塑料膜袋果的SPS1相对表达量在发育前期显著低于对照;影响了SUS1相对表达量的变化,整个发育过程未见套塑料膜袋果有SUS1相对表达量高峰出现,套黄蜡纸袋果的SUS1相对表达量最大值较对照提前15 d,之后显著低于对照。