野桑蚕中肠组织cDNA文库的构建及丝氨酸蛋白酶基因片段的克隆与序列分析

[目的]构建野桑蚕中肠组织cDNA文库并分离其丝氨酸蛋白酶基因。[方法]利用TaKaRa公司生产的cDNA Library Construction Kit构建了野桑蚕中肠组织的cDNA文库,并采用测序法克隆分析丝氨酸蛋白酶基因cDNA。[结果]经鉴定,文库的滴度达6.2×105pfu/ml,文库插入片段的平均大小为1.2 kb左右。从文库的测序结果中获得了野桑蚕丝氨酸蛋白酶基因片段(登录号:EU672968),序列分析结果显示:该基因片段由854个核苷酸组成,编码284个氨基酸残基。通过对该基因片段编码的氨基酸和其他10种昆虫的丝氨酸蛋白酶基因编码的氨基酸的同源性分析,发现该氨基酸序列与其他丝氨酸蛋白酶具有一定的同源性。[结论]该基因的发现对于研究家蚕和野桑蚕对外来入侵物的抗性具有重要意义。     

Molecular Systematic Studies on Chinese Mandarina Silkworm (Bombyx mandarina M. ) and Domestic Silkworm (Bombyx mori L.)

Molecular systematic studies on mandarina silkworm (Bombyx mandarina M. ) in 11 regions in China and 25 representative strains of domestic silkworm (Bombyx mori L. ) were conducted using molecular biology techniques. Results obtained from the analysis of DNA polymorphism and clustering of all the silkworm samples provide new evidence for the view that the domestic silkworm originated from the Chinese mandarina silkworm. On the basis of literature reviewing, a new hypothesis on the origin of the domestic silkworm was put forward. It was thought that the domestic silkworm was most probably domesticated from the Chinese mandarina silkworm of different ecotypes including monovoltinism, bivoitinism and multivoitinism; and that the domestic silkworm had the genetic background of monovoltinism, bivoltinism and multivoltinism at the very beginning of the domestication. The current strains of the domestic silkworm of different voltinism are the evolutionary results of thousands of years of rearing and artificial selections.     

SSR标记在中国野桑蚕和家蚕的遗传多态性分析中的应用

采用25个微卫星标记(SSR)对中国5个不同地区的野桑蚕及2个家蚕品种进行了多态性分折,共产生58个等位基因,平均每个位点多于2个等位基因。表明微卫星标记能反映各品种之间丰富的多态性,品种间的聚类结果较好地反映了家蚕和野桑蚕之间的遗传特性。     

中国野桑蚕抗病毒蛋白基因(Lipase)的克隆与活性鉴定

从中国野桑蚕幼虫中肠细胞克隆获得了抗家蚕核型多角体病毒BmNPV的脂肪酶基因(Lipase)cDNA(GenBank:AY945212)。该基因cDNA大小906 bp,编码301个氨基酸,蛋白质分子质量约为28.9 kD。进一步克隆了其全长基因组,结果表明该基因由2 147 bp组成,包含4个外显子和3个内含子。该基因在野桑蚕体内的表达具有组织特异性,仅限于野桑蚕中肠组织表达,且在幼虫龄中表达水平较高,而在幼虫眠期和熟蚕期几乎没有表达。通过基因体外表达获得的重组蛋白Lipase,能够有效抑制BmNPV病毒对家蚕的感染,说明该蛋白具有较强的抗BmNPV的生物学活性。     

野桑蚕和家蚕的环境适应性比较研究

野桑蚕和家蚕对不同组分人工饲料的食性比较研究表明 ,野桑蚕不取食无桑叶粉的人工饲料 ,4 8h不出现疏毛现象 ,其食性较家蚕单一。以完成虫态的积温研究二者对气象环境的适应性 ,发现野桑蚕对气象环境的适应性较家蚕强 ,野桑蚕完成不同虫态所需的有效积温较稳定。对野桑蚕和家蚕添食农药和紫外辐照处理 ,结果表明野桑蚕对不良的环境的耐受性较家蚕强 :添食相同浓度的农药 ,家蚕全部中毒死亡 ,而野桑蚕却部分存活 ,且正常化蛹 ;紫外线辐照可使野桑蚕提前老熟营茧     

野桑蚕和不同家蚕品系幼虫体内1-脱氧野尻霉素含量测定

采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)-紫外检测法测定了野桑蚕和不同品系家蚕体内的1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)含量,并调查了家蚕5龄幼虫不同组织不同生长时期1-DNJ含量的变化。野桑蚕与家蚕、家蚕不同品系间的1-DNJ含量存在极显著差异:野桑蚕全蚕粉中1-DNJ含量最高,质量分数平均为0.427 8%;家蚕以黄血蚕最低,平均0.220 5%。家蚕5龄幼虫不同组织的1-DNJ含量也存在明显差异:家蚕血干粉中的1-DNJ含量最高,质量分数达0.848 7%;其次是中肠、体壁和脂肪体组织,分别为0.512 2%、0.472 2%、0.308 5%;而在丝腺中几乎检测不出1-DNJ。家蚕5龄幼虫体内1-DNJ含量随发育时期呈明显变化,5龄第4天含量最高,达0.329%,第5天以后迅速下降。     

野蚕黑卵蜂繁育寄主的研究

室内、外试验研究均表明，野蚕黑卵蜂能寄生家蚕卵并顺利生长、发育、羽化。经分别用家蚕卵和野桑蚕卵作寄主连续繁殖3代后，野蚕黑卵蜂种群间并无显著差异产生。寄主卵的长时间冷藏并不影响寄生蜂的寄生和生长发育；家蚕卵和野桑蚕卵中卵浆游离氨基酸、卵浆蛋白氨基酸以及卵壳蛋白氨基酸在各类氨基酸组成上无差异存在，两者均能满足野蚕黑卵蜂的营养需要。总之家蚕卵是野蚕黑卵蜂进行室内大量繁殖的适宜寄主。     

中国野桑蚕和日本野桑蚕的RAPD研究

用RAPD PCR技术初步研究了中国野桑蚕与日本福冈野桑蚕之间的DNA多态性。结果表明 ,不同地域中国野桑蚕个体之间及其与日本福冈野桑蚕个体之间均呈现出丰富的DNA多态性。中国野桑蚕同家蚕共有带率达 3 5 5 % ,同日本福冈野桑蚕为 4 5 1% ,而日本福冈野桑蚕同家蚕为 3 2 % ;中国野桑蚕与家蚕的平均遗传距离为0 5 2 ,日本野桑蚕与家蚕的平均遗传距离为 0 6 3,与中国野桑蚕的为 0 5 8,而且与中国沈阳地区野桑蚕之间的遗传距离最近 ,为 0 4 8,以此创建了它们的系统进化树。     

野蚕卵和野蚕黑卵蜂寄生卵的空间分布型及其应用

用7种方法、11个聚集度指标,测定分析了越冬代和发生代野蚕卵块、卵粒、野蚕黑卵蜂寄生卵块、卵粒的空间分布型。结果,越冬代和发生代野蚕卵块均符合所拟合的Poisson分布,Neyman A型分市及负二项分布;聚集度指标表明:越冬代野蚕卵块、卵粒、被寄生卵块、卵粒呈聚集分布,发生代则以均匀分布为主。同时还考查了卵块在桑树各部位的分布,并确定了资料代换公式和最适抽样数,制定了发生代野蚕卵块的序贯抽样表。     

中国少棘蜈蚣与家蚕和野桑蚕肌球蛋白轻链2的结构功能分析比较

从中国少棘蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans)毒腺cDNA文库中克隆的肌球蛋白轻链2(MLC2)基因的cDNA,其开放阅读框为606 bp(GenBank登陆号为FJ262953),编码201个氨基酸,与家蚕(Bombyx mori)和野桑蚕(Bombyxmandarina)的MLC2等长,序列一致性达52%。3种MLC2都包含:1个同位且完整的EF-H功能域和Ca2+结合位,1个N端poly-lys基序及相同的丝氨酸磷酸化修饰位点。三级结构预测显示中国少棘蜈蚣MLC2的三维结构相似于乌贼(Loligo pealei)的同源模型,而家蚕和野桑蚕的则与淡色库蚊(Culexpipiens pallens)的MLC2一样类似于扇贝(Aequipecten irradians)的同源结构。分析结果有助于进一步研究家蚕和野桑蚕MLC2的结构功能及其功能应用。