禽呼肠孤病毒P17蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其ELISA检测方法的建立

用设计合成的1对跨越禽呼肠孤病毒（ARV）P17非结构蛋白基因完整开放阅读框（ORF）的特异性引物，对ARVS1133株进行了RT-PCR扩增。扩增产物与pGEX-4T-1原核表达载体连接后，转化大肠杆菌BL21感受态细胞。经0．2mmol／LIPTG诱导，表达的融合蛋白分子质量为42.4ku，占茵体总蛋白的34％。表达产物P17蛋白经不同浓度尿素纯化后，纯度达到85％。Western-blotting显示，纯化的P17蛋白能与感染ARV的阳性血清反应，说明其具有抗原性。以此重组蛋白为包被抗原初步建立了用于鉴别检测ARV活病毒感染与灭活疫苗免疫的SPF鸡血清的ELISA。     

青藏高原不同垂穗披碱草居群营养品质季节动态比较

摘要:对青藏高原地区6个垂穗披碱草（Elymus nutans）居群8个不同生育期的可溶性糖(WSC)和粗蛋白质(CP)含量进行了测定。结果表明,居群间不同生育期WSC和CP含量存在显著差异(P<0.05),种源地来自青海共和县居群和甘肃临潭县居群WSC含量在整个生育期显著高于其他4个居群;CP含量甘肃玛曲县居群显著高于其他居群。整个生育期,WSC含量呈单峰曲线,初花至盛花期最高(P<0.05),初花期WSC含量最高为6.91%,最低为1.58%,CP含量整体表现为下降趋势,完熟期最低。不同居群间WSC和CP含量均表现出一定变异度,其变异系数变幅分别为36.47%～51.29%和4.76%～20.29%。相关性分析表明,WSC与CP含量呈显著负相关。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核衣壳蛋白重组鸡痘病毒的构建

从含有猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核衣壳蛋白（N）的质粒扩增出N基因，构建禽痘病毒转移载体。该载体含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2控制之下的PRRSVN基因、P11启动下的报告基因lacZ以及用于同源重组的禽痘病毒基因组的片段。在转移载体转染亲本病毒S—FPV-017感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）之后，采用蓝色表型筛选的方法，筛选到表达N基因的重组病毒，并对其进行了6轮蚀斑纯化。PCR方法鉴定证明重组病毒的基因组中含有完整PRRSVN基因，间接免疫荧光试验证明了PRRSVN蛋白在重组病毒感染的CEF细胞中获得表达，本研究为猪繁殖与呼吸综合征非复制型疫苗的研制打下了基础。     

饲粮粗蛋白质水平对鲁西斗鸡肠道发育的影响

为探讨饲粮粗蛋白质水平对鲁西斗鸡肠道发育的影响,并建立肠道发育的生长模型,试验选用1日龄鲁西斗鸡雏鸡600只（公母各半）,随机分为5个处理,每个处理6个重复,每个重复20只。试验分为0～6、7～12、13～18、19～24周4个阶段,采用单因子试验设计,各处理组分别饲喂不同蛋白质水平的饲粮。在6、12、18、24周末,每重复屠宰1只进行肠道指标的测定。结果表明：（1）饲粮粗蛋白质水平对6、12、18、24周末十二指肠、空肠及回肠长度和重量均无显著影响（P＞0.05）;（2）鲁西斗鸡十二指肠、空肠及回肠重量随周龄变化符合Logistic模型。     

中国麇鹿朊蛋白核心片段的原核克隆表达与纯化

从采取的新鲜麋鹿血液中提取麋鹿基因组DNA,通过PCR的方法从麋鹿基因组中扩增麋鹿PrP蛋白核心片段的DNA,并分别在引物的5′和3′端引入EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点,下游引物将原序列TATTAC突变为TAAT从变成两个终止密码子。通过两个酶切位点将麋鹿PrP蛋白核心片段DNA连接到pET-32a（＋）,转化DH5α,通过酶切鉴定和PCR鉴定,筛选出阳性克隆送菌液测序,从测序结果分析阳性克隆是否符合要求。测序正确后将核心片段基因连接到pET-32a（＋）,阳性质粒命名为MPrP-pET-32a（＋）,阳性质粒转化E.coli BL21（DE3）,进行诱导表达、蛋白质纯化鉴定。     

猪链球菌2型38 000蛋白主要功能区基因的克隆与表达

根据GenBank中已发表的猪链球菌2型38000蛋白基因核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,采用PCR方法,以四川分离株猪链球菌2型基因组DNA为模板扩增38000蛋白主要功能区基因。将PCR产物纯化后与pMD18-T连接转化宿主菌DH5α,提取阳性质粒,进行PCR和酶切鉴定。将目的片段定向克隆到表达载体pET32a中,经测序正确后,重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),于37℃、0.8mmol/LIPTG条件下进行诱导表达,结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子质量约为35000的重组蛋白,表达产物经纯化后,免疫印迹法(Western blotting)证实该重组蛋白可以与猪链球菌2型阳性血清发生特异性反应。     

新城疫病毒融合蛋白单克隆抗体的研制

以纯化的新城疫病毒(NDV)R8E9免疫BALB／C小鼠，最后1次免疫后3d取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2／0)融合。以纯化的NDV和表达NDV融合蛋白(F)的重组鸡痘病毒(rFPV)分别建立了间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫荧光(IIF)方法，并用于单抗筛选的第一、二检测系统。经反复筛选并3次亚克隆后共获得7株针对F蛋白的单克隆抗体，它们的生物学特性和在不同反应系统中的敏感性各有不同。用这7株单抗对国内外不同时期分离的：NDV毒株进行排谱发现，单抗几乎可以与所有毒株反应，表明所得的单抗都是针对NDVF蛋白的抗原保守区。     

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒噬菌体单链抗体库的构建和筛选

为筛选牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）gP48蛋白的单链抗体,本研究利用噬菌体展示技术构建了gP48蛋白单链抗体克隆文库,通过微孔筛选法对抗体库进行3轮富集淘筛,利用ELISA技术测定单链抗体的亲和力,对亲和力较高的克隆进行基因测序分析和结合活性测定,旨在获得gP48蛋白的单链抗体。结果表明：1）成功构建了库容量为4.3×107的噬菌体单链抗体库,其重组率为83.3%,经三轮筛选对噬菌体抗体库进行富集,富集倍数为1.43×104;2）优化了间接ELISA方法,筛选到3株与BVDV gP48蛋白具有高亲和力的单链抗体以及其基因序列,通过IgBLAST分析显示,3株单链抗体均为鼠源IgG。综上,从gP48蛋白的单链抗体库中筛选获得3个具有高亲和力的单链抗体,可用于后续BVDV检测方法的建立。     

猪瘟病毒E2蛋白研究进展

猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,CSFV）引起的一种急性、接触性传染病。目前该病流行于除北美洲和大洋洲以外的其他大洲和地区,呈世界性分布,在一些原已宣布消灭猪瘟的欧洲国家（荷兰、比利时、英国、德国、意大利、西班牙等）又相继复发。虽然我国长期坚持全面接种猪瘟兔化弱毒疫苗,但目前猪瘟在我国依然存在,流行特点从以往的频发大面积流行转变为无规律区域性的散发,隐性持续性感染病例增多,因此应明确猪瘟病毒的基因组结构和最具免疫防制研究价值的抗原蛋白结构,为研制新型有效的疫苗和诊断试剂提供理论依据。本文就猪瘟病毒的基因组结构、猪瘟病毒E2蛋白的结构、功能、所包含的抗原表位以及E2蛋白的表达应用等方面的研究进展作以综述。     

检测鸭呼肠孤病毒抗体间接ELISA方法的建立

RT—PCR扩增鸭呼肠孤病毒（Duckreovirus,DRV）的dB基因,克隆到pET-32a（＋）表达载体,再转化大肠杆菌Transetta（DE3）;含有重组质粒pET—σB的大肠杆菌经IPTG诱导,获得大小为55000的以包涵体形式表达的σB重组蛋白。Westernblotting显示,σB重组蛋白能够与兔抗DRV多抗血清特异性结合。以高亲和NI—NTA树脂在变性条件下纯化、梯度尿素复性的σB重组蛋白为包被抗原,建立了检测DRV抗体的间接ELSIA方法。分别以间接ELSIA方法和血清中和试验对DRV感染鸭血清和SPF鸭血清进行检测,两者的符合率为100％。该间接ELSIA方法对鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒和禽流感病毒阳性血清均无交叉反应。