固定化漆酶对刚果红染料脱色降解的研究

[目的]探讨固定化漆酶脱色降解刚果红染料的最佳反应条件。[方法]以海藻酸钠为载体、戊二醛为交联剂,进行漆酶的固定化,并研究了固定化漆酶用量、染料浓度、反应温度和pH对染料脱色率的影响。[结果]固定化漆酶脱色降解刚果红染料的最佳条件为酶用量1 g,染料浓度40 mg/L,反应温度65℃,pH=4.5。在该条件下降解3 h,固定化漆酶对刚果红染料的脱色率达92.6%,重复利用5次后,脱色率仍能保持在50%左右。[结论]该研究为染料废水的有效处理提供了理论依据。     

灵芝漆酶在黑曲霉中的重组表达及发酵条件优化

【目的】 在黑曲霉（A.niger）中重组表达灵芝L菌漆酶基因，并对其发酵条件进行优化，旨在获得一株高产灵芝漆酶的黑曲霉基因工程菌。【方法】 从灵芝L菌克隆漆酶基因Lac-L，并根据黑曲霉密码子偏好性进行优化。选用黑曲霉糖化酶启动子（PglaA）、信号肽及终止子为表达原件，以米曲霉pyrG基因为筛选标记，构建漆酶表达盒，采用聚乙二醇-CaCl₂法将其转化至黑曲霉X1（ΔpyrG）原生质体中。对转化子进行PCR验证及固态发酵酶活测定，筛选高产漆酶重组菌株，并对阳性转化子固态发酵培养基碳源、无机与有机氮源比例、Cu²⁺浓度及发酵时间进行优化。【结果】 经尿嘧啶缺陷及含2，2'-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2，2'-azinobis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt），ABTS）培养基筛选获得25株重组漆酶转化子，酶活复筛获得灵芝漆酶异源表达6号重组菌株，发酵72 h酶活可达3 532.6 U/kg，宿主菌株的酶活仅为58.37 U/kg。重组6号菌优化后的最适固态发酵条件为：以麸皮为基础培养基，添加2%麦芽糖、2%（NH₄）₂SO₄、0.25 g/L CuSO₄，发酵60 h时重组菌株产漆酶活力最高，达到6 255.47 U/kg。【结论】 在黑曲霉中成功实现灵芝L菌漆酶基因Lac-L的异源表达。     

腐植酸对漆酶诱导雌激素自聚合动力学的影响

本文选择17β-雌二醇（E2）、17α-炔雌醇（EE2）和双酚A（BPA）作为环境中3种典型的代表性雌激素，采用批量平衡试验方法，研究了腐植酸（HA）对变色栓菌（Trametes versicolor）漆酶诱导雌激素转化动力学、产物分布和作用机制的影响。结果表明：漆酶在3 h内对3种雌激素的去除率均高于95%，E2、EE2和BPA的转化动力学常数（k）分别为2.48、2.03 h^-1和1.45 h^-1。添加HA有效抑制了E2 （k=1.04 h^-1）和EE2 （k=0.64 h^-1）的转化，但促进了BPA的去除（k=3.13 h^-1），漆酶诱导HA和长链BPA自聚物发生共聚合反应，所形成的BPA-HA共聚物快速降低了长链BPA自聚物的产量，从而消除了其对漆酶催化活性和稳定性的抑制作用。产物鉴定证实了雌激素的转化产物主要为二聚体、三聚体和四聚体等低聚物。雌激素和HA的共聚合机制分为2个步骤：首先，雌激素和HA被漆酶单电子氧化，该过程形成大量的活性自由基中间体；随后，这些不稳定的活性自由基中间体通过C-C、C-O-C或C-N-C键共价结合，生成多种结构复杂的雌激素自聚物和共聚物。研究表明，HA能够影响漆酶诱导雌激素自聚合，形成更加复杂的共聚合产物，从而消除环境雌激素污染、封存有机碳。