漆酶催化活性中心结构及其特性研究进展

漆酶是一种多酚氧化酶，参与木质素的降解或聚合，具有氧化木质素的能力，但不同来源的漆酶其氧化降解木质素的能力相差很大。漆酶的结构决定了漆酶的特性，因而也就决定了漆酶氧化降解木质素的能力。本文综述了近10年来漆酶分子催化活性中心的结构与功能及其特性的研究进展。     

漆树酶的固定化——Ⅰ聚丙烯酰胺包埋法固定化漆树酶

漆树酶(BC.1.10.3.2)从生漆中提取后,用聚丙烯酰胺包埋固定化。研究了固定化的条件,以及固定化漆树酶的重复使用性和耐热性,测定了它的米氏常数,并与天然漆树酶进行了比较。固定化漆树酶的活力回收可达30％;重复使用十多次后其活性还保留约80％;在干燥状态下,固定化漆树酶非常耐热。     

漆树酶的固定化——Ⅳ.固定化漆树酶催化陈漆复活制备“超级生漆膜”

研究了两种固定化漆树酶(聚丙烯酰胺包埋漆树酶和ABSE-交联琼脂共价偶联漆树酶)催化陈漆漆酚氧化聚合,实现了“陈漆复活”。首次制备了室温自干的“超级生漆膜”。它的8项物理性能指标:流平性、干燥不受湿度的影响性、实干速度、色泽、光泽值、冲击强度、柔韧性(弹性)和附着力在不同程度上均超过了一般生漆膜。这种固定化漆树酶催化漆酚氧化聚合的技术路线使本来纠缠在一起的复杂的生漆成膜过程分解为比较单一的漆酚氧化、聚合过程和线性聚合物交联过程,因而有利于彻底弄清生漆成膜的反应机理,也有利于阐明天然生漆各组分如胶质(树胶质)等对生漆成膜的贡献。     

白腐菌糙皮侧尔漆酶性质及其对蒽醌染料脱色性能的研究

白腐菌糙皮侧尔(Pleurotus ostreatus strain 3.42)分泌胞外漆酶，但未发现分泌木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)、每升反应液以0．5mmol 2，2′-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)和0．1mmol的Cu^2 为诱导剂可明显提高漆酶酶活，酶活分别可达1000和800U／mL。与其它真菌漆酶相比，该酶最适反应pH值为3．5，在pH值4．0～6．0之间酶活性稳定；最适反应温度为65℃，在醋酸缓冲液(pH值5．0)中，反应温度低于50℃时，漆酶非常稳定；该酶对对-甲氧基酚的氧化速度要快于邻-甲氧基酚。叠氮化钠对该漆酶有强烈的抑制作用。蒽醌染料活性艳蓝KN-R(RBBR)可被该漆酶(30U／mL)直接脱色，12h脱色率为70％；添加小分子的介体物质ABTS(5μmol／L)，可使染料完全脱色。     

漆酶处理条件对枫香湿法纤维板强度的影响

为消除人造板的游离甲醛污染,开发一种无胶人造板生产工艺,以漆酶和枫香纤维为原料,进行纤维板的工艺研究.以湿法生产纤维板,并检测板材的内结合强度(IB),结果表明:漆酶处理纤维板的IB值高于对照板;处理温度、时间和酶用量对纤维板的IB均有显著影响;最佳处理条件为pH 3.0,50 ℃,2 h,20 U/g纤维.     

无柄灵芝菌LZ02高产漆酶条件及部分酶学性质分析

【目的】 从采自新疆天山的无柄灵芝菌(G.resinaceum)中筛选获得1株高产漆酶的LZ02菌株,对其产酶条件进行优化,研究部分酶学性质。【方法】 采用单因素实验,对其产酶条件优化并研究其酶学特性,采用双向电泳检测酶蛋白。【结果】 LZ02菌株产漆酶的最佳碳源为2.5%麦麸+1%葡萄糖,最佳氮源为干酪素; Cu²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、 Zn²⁺和Ca²⁺的添加对LZ02产漆酶有一定的促进作用,而Co²⁺具有明显的抑制作用;藜芦醇和愈创木酚抑制产酶并使产酶高峰由第3 d推后至第9 d,添加没食子酸和ABTS对产酶影响不大,单宁酸对产酶有抑制作用。LZ02菌漆酶最适反应温度为60℃,且在80℃仍具有漆酶活性;在40℃,pH 4.0~5.0,酶活性最稳定;最适反应pH为3.0,Mn²⁺ 、Zn²⁺、 Cu²⁺ 、Ba²⁺和K⁺对酶稳定性有一定的促进作用,Co²⁺、Cd²⁺、Cr²⁺和Pb²⁺对酶的稳定性具有明显的破坏作用;对菌体及发酵液进行了双向电泳检测,测定其等电点为4.1;获得了1个纯化酶蛋白质谱序列,该蛋白与Ganoderma Lucidum来源的Laccase高度同源。【结论】 无柄灵芝菌(G.resinaceum)漆酶的合成和分泌受到营养水平、培养条件、生长阶段以及培养基中诱导剂的严格调控,木质素或木质素相关的芳香类化合物、N源和C源也能调节漆酶的合成;漆酶活性对不同种类、不同浓度的金属离子以及诱导剂的响应不尽相同,其具有较复杂的生理功能及调控机制。     

漆酶催化生物体内有机物合成与分解代谢的双功能机制及其在生物技术领域中的应用

本文简要概述了漆酶分子的化学结构、底物谱和催化功能,重点分析了酚类化合物对漆酶介导生物体内有机物合成与分解代谢的影响及其双功能作用机制,总结并展望了漆酶的双功能属性在生物技术领域中的最新应用前景,旨在为拓展和开发漆酶的多功能应用提供新颖的见解和思路。     

杧果炭疽病菌 3 个果胶裂解酶基因序列特征及受漆酶基因Lac1 影响的分析

果胶裂解酶是炭疽菌在侵染寄主过程中降解寄主细胞壁的一类重要水解酶。本研究在杧果炭疽病菌中克隆获得了 3 个果胶裂解酶基因 Cgpel1、Cgpel2 和 Cgpel3，DNA 全长分别为 1 037、1 498、1 089 bp，cDNA 全长分别为 975、 1 380、978 bp，分别编码 324、459、325 个氨基酸，均含 1 个果胶裂解酶保守结构域，均有典型的信号肽，不存在跨膜结构。其二级结构中 α-螺旋分别占 16.05%、20.26%、16.92%，延伸链分别占 28.09%、21.79%、29.54%，β-转角分别占 5.86%、8.93%、7.38%，无规则卷曲分别占 50.00%、49.02%、46.15%。Cgpel1、Cgpel2 和 Cgpel3 的氨基酸序列分别与 C. tofieldiae（KZL77240.1）、草莓炭疽菌（C. gloeosporioides）（XP-007274932.1）、C. incanum（KZL84476.1）果胶裂解酶序列相似度在 93%以上。qRT-PCR 分析发现，3 个果胶裂解酶基因在整个侵染过程中均持续高效表达，但在漆酶基因 Lac1 敲除突变体中，表达均下降约 90%。可见 Cgpel1、Cgpel2 和 Cgpel3 是果胶裂解酶基因家族成员，序列差异较大，在侵染过程中起着重要的作用，且其表达受漆酶基因 Lac1 影响。     

亚洲玉米螟两种漆酶基因OfLac1和OfLac2 cDNA 的克隆及基因表达

【目的】克隆亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）漆酶-1（OfLac1）和漆酶-2（OfLac2）基因;研究OfLac1和OfLac2在亚洲玉米螟不同发育阶段和不同组织中的表达特异性;分析蜕皮激素处理亚洲玉米螟后OfLac1和OfLac2基因表达量的变化;比较OfLac1和OfLac2表达模式的差别,推测其生理功能。【方法】根据已知的其他昆虫中Lac-1和Lac-2的保守氨基酸序列分别设计引物,以亚洲玉米螟白蛹时期提取的RNA反转录合成的cDNA为模板,通过PCR扩增OfLac1和OfLac2的保守区。然后根据所得的保守区片段分别设计基因特异性引物,采用RACE方法分别克隆OfLac1和OfLac2的3′和5′端序列,通过拼接获得OfLac1和OfLac2的基因全长。收集5龄第4天亚洲玉米螟的表皮、中肠、脂肪体、丝腺、气管、马氏管、精巢7种不同组织材料,通过半定量PCR分析OfLac1和OfLac2在不同组织中的基因表达模式。收集从卵到成虫29个不同生长发育时期的亚洲玉米螟作为材料,采用实时荧光定量PCR分析OfLac1和OfLac2在不同发育时期的基因表达水平。选取5龄第2天亚洲玉米螟幼虫进行蜕皮激素注射,分别在1、4、8、12和24 h后取样,利用实时荧光定量PCR研究OfLac1和OfLac2在蜕皮激素诱导下的基因表达水平。【结果】克隆获得亚洲玉米螟OfLac1和OfLac2的 cDNA序列。OfLac1全长3 065 bp,其中5′非编码区222 bp,3′非编码区440 bp,开放阅读框2 403 bp,共编码800个氨基酸,其编码的蛋白分子质量约为90.6 kD,理论等电点pI为5.34;OfLac2全长3 405 bp,其中5′非编码区162 bp,3′非编码区960 bp,开放阅读框2 283bp,共编码760个氨基酸,其编码的蛋白分子质量约为84.0 kD,理论等电点pI为6.43。通过SignalP分析发现,OfLac1在N端包含一个长为22个氨基酸的信号肽,OfLac2在N端包含一个长为23个氨基酸的信号肽,均为分泌蛋白质。基因表达模式分析表明,在发育过程中,OfLac1主要在成虫中表达,在其他发育时期表达量较低;OfLac2在每个幼虫龄期的末期表达水平上调,在幼虫化蛹过程中的预蛹期表达量最高;在不同组织中,OfLac1在马氏管和中肠中表达量最高,在气管和表皮中的表达量较低,在精巢、丝腺和脂肪体中几乎不表达;OfLac2在中肠和丝腺中表达量最高,在气管和表皮中的表达量较低,在精巢、马氏管和脂肪体中几乎检测不到表达。将蜕皮激素20E注射到亚洲玉米螟体内,OfLac1在注射24 h后表达量明显上调,OfLac2在注射12 h后表达量开始上调,在24 h后上调最明显。【结论】克隆得到亚洲玉米螟两种漆酶OfLac1和OfLac2的cDNA序列。两种漆酶基因的表达模式存在明显差别,但都受蜕皮激素的调控。OfLac2可能参与蜕皮过程表皮褐化。     

扁芝漆酶诱导与产生的初步研究

该文采用定期测定基础培养基Ⅰ、Ⅱ培养体系中 ,诱导或不诱导条件下菌丝生物量、漆酶活性、pH、残糖量变化的方法 ,研究了液体培养过程中 ,白腐菌扁芝漆酶的诱导和产生规律 .结果发现 ,加入DL β 苯丙氨酸或愈创木酚的培养基中 ,培养 1d漆酶活性就达到高峰 ,分别为同步培养的基础培养基Ⅰ漆酶活性的 5 76倍和 4 2 8倍 ;培养5d后 ,基础培养基Ⅰ、加入香兰素的培养基的漆酶活性才达到高峰 ;基础培养基Ⅱ在培养 6d时出现漆酶活性高峰 ,与基础培养基Ⅰ产漆酶历程相似 .证明基础培养基Ⅰ培养体系中的DL β 苯丙氨酸或愈创木酚对扁芝漆酶产生有明显的诱导作用 ,香兰素则有一定的抑制作用 ;基础培养基Ⅱ培养体系中硫酸铜对漆酶活性诱导作用高于藜芦醇