CnAβ基因对大鼠RBL-2H3细胞脱颗粒的影响

过敏是人和养殖动物常见的疾病,而且发生的频率呈现逐渐增加的趋势.为了深入了解过敏反应的机制,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建钙调磷酸酶A beta(calcineurin A beta,CnAβ)基因敲除的大鼠RBL-2H3细胞株,并探讨CnAβ基因对RBL-2H3细胞生长及脱颗粒的影响.选取大鼠Cn...     

J亚群禽白血病SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种能够快速、灵敏和特异地检测J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法,本研究以ALV-J原型病毒株HPRS-103的pol基因3′端与gp85编码基因之间的保守区域(5 258 bp～5 802 bp)为检测目的片段,构建重组质粒并作为靶基因,通过对其浓度、引物浓度和退火温度的优化,建立了ALV-J SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法.结果显示该方法的最低检测限度为2.36×102拷贝/μL,比普通PCR高100倍;与其他禽源病毒无交叉反应;批内和批间变异系数均小于5％.表明本研究建立的方法具有良好的特异性、稳定性和灵敏性.采用该方法对100只临床病鸡进行检测,ALV的检出率为44％.随机选择10只感染阳性鸡,检测病毒基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的分布与表达水平,结果表明ALV-J在各主要脏器中均有分布,但以肾脏中的病毒表达量最高.     

饲粮蛋白质源对断奶仔猪小肠全基因组转录谱的影响

为探讨饲粮蛋白质源影响断奶仔猪小肠发育的分子机制,本试验利用猪全基因组表达谱芯片分析不同蛋白质源饲粮下断奶仔猪（断奶 ０、３、７和 １４ｄ）小肠转录谱,２４头仔公猪随机分为 ２个处理,处理 １采用乳源蛋白质 ３０％替代饲粮总蛋白质,处理 ２采用全植物蛋白质源饲粮。结果表明：１）处理 １获得 ３７０个差异表达基因（Ｐ＜０．０５）,采用序列试验聚类分析,共获得２６个表达模式,其中有 ３个显著表达模式,模式 ５和 １１显著性水平最高（Ｐ＜０．０１）。处理 ２获得 ２６３个差异表达基因（Ｐ＜０．０５）,序列试验聚类分析得到 ２６个表达模式,其中模式 ３和 ２２显著水平最高（Ｐ＜０．０１）。２）基因共表达网络构建和分析一定程度上揭示了不同蛋白质源饲粮对肠道发育的分子调控机制,以及两者之间的差异。通过基因芯片数据,从 ２种蛋白质源饲粮处理下的基因调控网络中筛选出 １２和 ９个具有重要影响和研究价值的基因,以及 ９个在 ２个处理中网络调控地位发生改变的共表达基因。通过基因芯片数据,从 ２种蛋白质源饲粮处理下的基因调控网络中筛选出 １２和 ９个具有重要影响和研究价值的基因,以及 ９个在 ２个处理中网络调控地位发生改变的共表达基因。总之,本试验筛选出了一些在不同饲粮蛋白质源影响断奶仔猪肠道发育和功能过程中可能具有深入研究意义的候选基因。     

用PCR检测副溶血性弧菌耐热溶血素基因

根据副溶血性弧菌的耐热溶血素基因（ｔｄｈ）设计了２对引物，经聚合酶链式反应（ＰＣＲ）检测，所有１８株神奈川试验阳性副溶血性弧菌均呈阳性反应，而６株神奈川试验阴性副溶血性弧菌呈阴性反应，其他９种（３４株）弧菌和８株其他革兰氏阴性菌也呈阴性反应。检测敏感性可达２ＣＦＵ的副溶血性弧菌。     

牛抵抗素基因的克隆及原核表达

从健康新生牛大网膜脂肪组织中提取总RNA,根据已发表的牛Resistin mRNA序列设计、合成引物,通过RT-PCR进行cDNA扩增,获得了343 bp的片段。将该片段克隆于pMD18-T载体后进行序列分析,确认PCR产物为牛Resistin cDNA。从阳性克隆中提取质粒,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,回收343 bp的目的片段,定向克隆到pGEX-6P-1表达载体中,提取质粒并再次转化到BL21(DE3)中,成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,通过SDS-PAGE检测出牛的Resistin基因的表达。     

H5亚型禽流感病毒HA基因在重组杆状病毒中的表达及检测

利用杆状病毒表达系统对H5亚型禽流感病毒HA基因在sf9细胞中的表达进行了研究。首先将pUCm—T—H5HA质粒用BamHⅠ及NotⅠ酶切，获得HA基因片段，同时杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ也用BamHⅠ及NotⅠ酶切，然后用T4DNA连接酶连接，构建了重组质粒pFastBac—H5HA。再将该重组质粒转化DH10Bac感受态细菌，在体内进行重组，并经三重抗性与蓝白斑筛选，得到杆状病毒重组质粒Bacmid—H5HA。将Bacmid—H5HA转染sf9细胞，获得重组杆状病毒，经SDS—PAGE和Western blotting检测表明，HA蛋白在重组杆状病毒中获得表达。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒（AIV）A／Goose／HLJ／p46／2003（H5N1）的NSl基因，将其克隆于融合蛋白表达载体pMAL-c2X上，转化DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定及序列分析，表明筛选到了重组质粒pc2X-NS1。SDS-PAGE电泳结果显示，重组质粒转化TB1大肠埃希氏菌后，经0．3mmol／L的IPTG诱导，融合蛋白MBP-NS1得到大量表达，融合蛋白以可溶形式存在，分子质量约为67ku。Western-blotting检测结果表明，融合蛋白MBP-NS1能够与H5N1亚型AIV活病毒感染康复鸭血清发生特异性反应，而不能够与H5N1亚型AIV灭活疫苗免疫鸭血清发生反应。试验初步建立了以纯化的融合蛋白MBP-NS1为包被抗原的间接ELISA检测方法，为AIV灭活疫苗免疫家禽与AIV感染家禽的鉴别诊断奠定了基础。     

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建及在 IBRS-2细胞内的表达

采用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的基因,克隆入pMD18-T载体,转化至E.coliDH5α感受态细胞,经抗性平板筛选、小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定后,亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1。然后筛选含有目的基因的重组质粒,并转染IBRS-2细胞,在G418压力下进行筛选,利用SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测表达情况。结果显示,扩增的MIC3基因与GenBank上相应基因序列(AJ132530)的一致性达99.9%,构建的真核表达质粒pcMIC3能在转染的IBRS-2细胞中表达分子量约为39.2ku的MIC3,且表达的蛋白质具有良好的免疫活性,为进一步研究该质粒的动物免疫试验奠定了基础。     

猪接种PRRSV Nsp2Δ1882-2241弱毒株后血清细胞因子的变化特征

为了解Nsp2Δ1882-2241缺失后弱化的高致病性PRRSV（TJM株）对宿主免疫学应答的刺激机理,本研究分析了免疫猪血清中的细胞因子及变化规律。将14头4周龄易感仔猪随机分为3组：第1组接种PRRSV TJM-F92株,为免疫组;第2组接种高致病性PRRSV TJ-F5毒株,为攻毒组;第3组不接种疫苗及病毒,为对照组。接种后28d,用TJ-F5毒株攻击试验猪,于不同时间点采集血样,用ELISA法测定血清中的PRRSV抗体、IL-2、IL-10、IL-12p40、TNF-α、IFN-α和IFN-β水平。结果显示：（1）与对照组和攻毒组相比,免疫组猪IL-12p40水平持续上调,于免疫后28d受PRRSV强毒攻击后,其水平开始缓慢降低,但仍高于攻毒后的对照组。（2）免疫组IL-2水平在接种疫苗后的前21d内无明显升高且低于攻毒组,在受到强毒攻击后其IL-2水平却有明显升高。（3）免疫组IL-10水平与对照组无明显差别,并在免疫14d后一直显著低于攻毒组（P〈0.01）。（4）免疫组接种疫苗后的前21d内,TNF-α水平保持稳定,28d明显上调。攻毒组TNF-α水平0～28d一直低于对照组,且在21d达到最低（P〈0.01）。免疫组在28d受强毒攻击后,其TNF-α水平下降且在攻毒7d时最为明显（P〈0.01）,此后恢复到正常水平。（5）免疫组免疫后28d时IFN-α水平升高,在受到强毒攻击后再次显著降低（P〈0.01）。免疫组IFN-β水平一直低于对照组和攻毒组,不因强毒攻击而变化。以上结果提示,IL-12上调在PRRSV免疫保护中起明显作用;另外,上调TNF-α及下调IL-10都是基因缺失疫苗发挥效力的潜在机制。     

副溶血性弧菌PCR检测方法的建立

为了建立适于基层单位应用的针对副溶血性弧菌检测的特异PCR方法,检测副溶血性弧菌的基因序列.针对该菌的属特异性基因t1基因进行引物设计,扩增片段大小为449 bp.运用该PCR法可特异性的从副溶血性弧菌ATCC17802标准株中扩增出目的基因片段,与GenBank上发表的序列同源性为100%.而经常污染海产品的溶藻弧菌,嗜水气单胞茵标准株J-1,铜绿假单胞茵标准株ATCC27853结果均为阴性.该PCR法最低检出菌体DNA量为10-2ng以及最低检出菌数为5.7 × 103 CFU/mL.对临床上送检的35份样品进行菌体DNA PCR方法检测并同时与国标GB/T4789.7-2003中使用的检测方法进行比对,两种检测方法的结果完全符合,与国标中使用的检测方法相比可大大缩短鉴定时间.因此该PCR法能快速鉴定当前副溶血性弧菌流行群,有利于流行病学溯源等研究.