水稻启动子OsN1p的克隆与功能分析

将OsN1基因上游881 bp启动子(OsN1p)序列取代pBI121中gus基因上游的35S启动子,构建植物表达载体pBIN1p,经农杆菌介导转化水稻品种‘日本晴’,获得转基因植株。GUS组织化学染色结果表明,由该启动子驱动的gus基因能在愈伤组织中较低水平地表达;稻瘟病菌接种转基因植株24 h后,GUS活性为未接种前的4.2倍;5 mmol.L-1水杨酸(SA)和0.5 mmol.L-1茉莉酸甲酯(MeJA)分别喷施转基因植株叶面6 h后,GUS活性分别为处理前的5.9和2.4倍。表明,OsN1p启动子具有启动活性,同时明显具有受稻瘟病菌、SA和MeJA诱导表达的特性。     

捻转血矛线虫肌动蛋白基因的克隆与表达及其DNA疫苗的构建

根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析发现,该基因获得了表达,且以包涵体的形式存在,融合蛋白相对分子质量约46×103。以此重组蛋白为抗原,用自然感染捻转血矛线虫山羊血清为第一抗体进行Western blot分析,结果出现1条特异性条带,表明捻转血矛线虫Actin蛋白在自然感染过程中能被宿主的免疫系统识别,可能是一种天然抗原。用纯化重组Actin蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以该血清为第一抗体进行Western blot,结果发现该血清能识别捻转血矛线虫成虫蛋白谱中相对分子质量约为42×103的蛋白条带。将捻转血矛线虫actin基因亚克隆到真核表达载体pVAX1中,构建了DNA疫苗pVAX1-ACT,动物免疫试验结果表明该DNA疫苗在机体内获得了表达。     

甘薯卷叶病毒江苏分离物基因组全长序列测定及其外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

为了制备甘薯卷叶病毒(SPLCV)的特异性抗体,克隆了甘薯卷叶病毒江苏分离物SPLCV(JS∶XZ∶3-2)的全长基因,并对其基因结构及分子变异情况进行分析,同时对外壳蛋白(CP)基因进行了克隆和表达。利用PCR方法扩增并克隆了SPLCV(JS∶XZ∶3-2)的全基因组,测序分析表明,SPLCV(JS∶XZ∶3-2)基因组全长为2 834bp,含有6个开放阅读框架,与已发表的SPLCV其他分离物相比,全基因组核苷酸序列相似性为82.7%～94.4%。其中,CP基因由765个核苷酸组成,共编码254个氨基酸残基。SPLCV CP基因核苷酸序列与其他分离物的相似性在89.2%～90.6%,其中与SPLCV美国分离物(HQ333135)的相似性最高,为90.6%;与日本分离物(AB433788)的相似性最低,为89.2%;与中国大陆分离物(FJ515896)CP基因的核苷酸序列相似性为90.2%。将SPLCV CP基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-3上,获得重组质粒,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE分析得到了大小约为54.3kD的融合蛋白条带,说明CP基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

犬巴贝西虫病PCR检测方法的建立

为快速、准确检测犬巴贝西虫病,根据GenBank中收录的犬的巴贝西虫18sRNA基因序列,设计合成1对特异性诊断引物,建立了PCR诊断方法。结果扩增出了犬巴贝西虫18sRNA基因的一段大小为319bp片段,经测序,所扩增序列与报道的序列完全匹配。同时对附红细胞体、巴氏杆菌DNA样品进行扩增没有出现扩增条带。阳性犬全血DNA稀释1 000倍后,依然可以有效地检测出虫体DNA。结果表明,所建立的PCR检测方法,具有极高的敏感性和特异性,可以运用于临床检测巴贝西虫病。     

一种新型生物能源发光苔藓的研究

利用转基因技术将萤火虫的荧光基因和苔藓融合,产生一种新的生物替代能源,其原理是通过荧光现象和光合作用的协同,实现低消耗的能量循环,成为一个自给自足的供光体系。作为地下的供光系统,苔藓的某些生活特性可以有效地解决矿难的发生。其衍生品光苔灯,可以应用到公共环境照明中。以光苔能源改善社会的能源结构,从而达到可持续发展的目的,实现绿色能源的广泛普及。     

水稻细菌性条斑病抗性QTL微卫星标记的筛选及其在基因聚合育种研究中的应用

以高抗细条病水稻品系Dular和H359R为抗性供体亲本,在筛选与抗病基因紧密连锁的SSR分子标记的基础上,通过混合选择结合MAS技术的方法,将QTL聚合在一起。连锁SSR标记的筛选结果表明,紧密连锁的SSR标记与相应的目标QTL的推测距离在0.4～4.9cM,可以满足MAS对标记选择准确率的要求。MAS选择结果表明,有效聚合2～4个目标QTL是培育广谱抗细条病品种的有效途径。     

人CD46基因启动子的克隆和启动特性研究

为研究人CD46(hCD46)基因启动子的启动特性,研制具有hCD46组织特异性表达特征的转基因小鼠,设计扩增hCD46基因启动子的PCR引物,用HeLa细胞基因组DNA为模板扩增hCD46基因启动子DNA片段,测序结果表明:其序列与GenBank中hCD46完整基因5′端某片段的同源性高达99.9%。用此DNA片段替换表达载体pcD-NA3EGFP中的CMV启动子,且在该片段与EGFP基因之间插入兔β-球蛋白基因的第2内含子RGI。重构的表达载体在2种鼠源细胞CHO和SP2/0中均可启动EGFP表达,表达量与人体内同源组织中hCD46的相似,说明该研究克隆了结构和功能正确的hCD46基因启动子。     

中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹线粒体细胞色素b基因片段的DGGE分析

[目的]探讨利用DGGE技术对中华绒螯蟹和合浦绒螯蟹遗传多样性进行分析的可能性。[方法]对中华绒螯蟹5个群体和合浦绒螯蟹1个群体共180个个体的线粒体细胞色素b（cytb）基因片段进行了PCR扩增和变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析。[结果]所有PCR产物在DGGE电泳时共有2种迁移速率,合浦绒螯蟹所有个体的PCR产物的迁移速率相同,且中华绒螯蟹江都群体46.7%、仪征群体23.3%以及温州群体20.0%的个体与合浦绒螯蟹的迁移速率一致;而以上3个中华绒螯蟹群体的其他个体以及南京、盘锦群体所有个体的PCR产物在DGGE电泳时的迁移速率均相同,均快于合浦绒螯蟹,表明在中华绒螯蟹中混杂有合浦绒螯蟹的遗传标记类型。[结论]DGGE方法可用于绒螯蟹的遗传多样性分析。     

表达犬瘟热H基因重组伪狂犬病毒的构建及生物学特性研究

[目的]构建表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,并研究其生物学特性。[方法]通过RT-PCR方法获得Onderstepoort株H基因,插入pcDNA3.1（＋）建立好完整的真核细胞表达盒并将此表达盒亚克隆到转移载体p8AA上。在此基础上再将报告基因LacZ的表达盒插入转移载体,命名为p8AAZH。将p8AAZH与伪狂犬病毒（PRV）Bartha-K61株基因组共转染至BHK-21细胞中进行基因重组包装出毒,待细胞病变后收集病毒液。通过蓝色蚀斑筛选、PCR、电镜观察以及Westernblot,筛选纯化重组病毒并鉴定目的基因的表达。同时在BHK-21细胞上测定重组病毒的生长曲线。[结果]获得了表达H蛋白的重组伪狂犬病毒,重组病毒与亲本Bartha-K61株的生长曲线、病变特征相一致。[结论]成功构建了表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,H基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,为犬瘟热活病毒载体疫苗的研制与开发打下基础。