猪伪狂犬病毒gB基因序列分析

2011年以来我国多省免疫猪伪狂犬病毒gE基因缺失苗猪场出现变异型猪伪狂犬病毒(PRV)感染,经典猪伪狂犬病毒疫苗(Bartha-k61)对该病无法提供100%有效保护,已有研究发现变异型PRV和经典PRV gE基因存在特征性变异。为明确变异型PRVgB基因特征,本研究对GenBank中登录的部分PRV代表株gB基因进行分析比较。结果表明,我国经典型和变异型PRV在gB蛋白氨基酸编码区第395位、453位、562位和739位存在特征性差异,但不同来源PRVgB基因的核苷酸和氨基酸同源性分别在98.1%~100%和96.1%~100%。从相互之间的遗传进化关系可以看出,PRV遗传进化出现两个大的遗传分支,呈现明显的地域性。新发变异型和经典型PRV在中国PRV遗传进化分支上呈现各自独立进化小分支;我国近年分离的貉源和约克夏梗犬源与新发变异型PRV则处于同一进化小分支。     

茶渣蛋白提取工艺条件的优化

为实现茶渣副产物资源的综合利用,提高茶渣蛋白提取率,用碱浸提法提取废茶渣蛋白,通过单因素试验分析不同提取温度、NaOH浓度、提取时间和液固比对茶渣蛋白提取得率的影响。并在单因素筛选试验的基础上,运用Design Expert 8统计分析软件,设计4因素5水平响应面试验对提取温度、NaOH浓度、提取时间和液固比进行优化。结果表明:茶渣蛋白的最佳提取条件为提取温度50℃、NaOH浓度0.1mol/L、液固比45∶1、提取时间4h;在该条件下,茶渣蛋白提取得率为58.94%。     

抗纤灵Ⅰ方对小鼠血吸虫病肝纤维化的干预及机制探讨

目的 观察抗纤灵Ⅰ方对小鼠血吸虫病肝纤维化的干预效果,探讨抗纤灵Ⅰ方干预血吸虫肝纤维化的可能分子机制,为抗纤灵Ⅰ方的临床应用提供实验依据。方法 采用日本血吸虫尾蚴经皮肤贴片感染昆明小鼠,建立血吸虫病早期肝纤维化动物模型,将建模成功的小鼠用吡喹酮药物连续杀虫治疗后分为抗纤灵Ⅰ方低、中、高剂量组,抗纤灵Ⅰ方的丹参加味方低、中、高剂量组,秋水仙素治疗对照组,蒸馏水灌胃对照组和未做任何处理的模型对照9组。以未感染血吸虫的正常小鼠为肝纤维化阴性对照组。各实验组连续灌胃治疗8周,收集各组小鼠肝脏,HE染色观察肝纤维化病理改变,测量肝组织虫卵肉芽肿平均面积;免疫组化染色方法检测肝组织内胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、MMP-1蛋白酶以及TIMP-1蛋白的表达,比较各组间的蛋白表达差异。结果 HE染色显示,与模型组和正常对照组相比抗纤灵Ⅰ方及其丹参加味方高剂量组可显著减少肝组织虫卵肉芽肿面积（P<0.05）;免疫组化染色结果显示,与模型组比较,抗纤灵Ⅰ方及其丹参加味方中、高剂量组干预后小鼠肝组织内的胶原Ⅰ、Ⅲ蛋白以及TIMP-1蛋白表达显著减少（P<0.05）、MMP-1蛋白酶表达显著增加（P<0.05）,但抗纤灵Ⅰ方与丹参加味方之间差异无统计学意义（P>0.05）。结论 抗纤灵Ⅰ方及其丹参加味方对小鼠血吸虫病肝纤维化具有较好的干预效果,但两者在疗效上差异无统计学意义,丹参未能增强抗纤灵Ⅰ方的干预肝纤维化效果;抗纤灵Ⅰ方的干预机制可能是通过抑制肝组织内胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ和TIMP-1蛋白的表达,增加MMP-1蛋白酶的表达来发挥作用。     

超敏蛋白诱导水稻对立枯病的抗性

[目的]明确超敏蛋白对水稻立枯病的诱抗作用。[方法]以龙粳37水稻品种为试验材料,研究不同浓度超敏蛋白浸种处理对水稻生长发育的影响,测定超敏蛋白处理后水稻苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)含量变化。[结果]不同浓度超敏蛋白对水稻生长发育均有促进作用,且与对照相比不同浓度超敏蛋白处理水稻均不同程度地诱导了水稻防御酶PAL、POD和PPO活性,以稀释20倍的超敏蛋白诱导能力最强。[结论]研究结果为超敏蛋白抗病机理研究提供了理论依据。     

干旱胁迫下香蕉幼苗蛋白质组学分析

[目的]研究干旱胁迫下香蕉蛋白表达情况,为探索香蕉的抗旱分子机制提供理论依据.[方法]以桂蕉1号组培苗叶片为材料,对其进行干旱胁迫处理,运用iTRAQ结合液相色谱—质谱联用(LC-MS-MS)技术对其差异蛋白进行检测,并通过生物信息学分析对香蕉叶片蛋白质组进行鉴定.[结果]从干旱胁迫处理的组培苗叶片中共鉴定出1655种蛋白,其中获得定量信息的蛋白有1023种,差异表达蛋白78种,包括上调蛋白32种和下调蛋白46种.GO生物进程分析结果表明,78种差异表达蛋白参与了细胞过程、代谢过程、响应刺激胁迫过程及单有机体过程等多个生物进程.GO分子功能分析结果表明,上调蛋白主要具有催化活性功能、结合功能、抗氧化活性和功能调节;下调蛋白主要具有催化活性功能和结合功能.GO富集分析结果显示,上调蛋白主要参与过氧化氢反应、活性氧反应等;下调蛋白主要参与淀粉代谢、二糖代谢、蔗糖代谢、寡糖代谢、细胞碳水化合物生物合成等多个碳素代谢进程,且其主要是质外体、胞外区、类囊体等部位的组分,参与1,6-二磷酸果糖1-磷酸酶反应、蔗糖磷酸酶反应及碳水化合物磷酸酶反应等.在氮素代谢过程中,参与甘氨酸代谢的丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)在线粒体中的含量明显下降,而参与活性氧代谢的过氧化氢酶(CAT)含量明显上升.[结论]干旱胁迫下香蕉的表达蛋白种类及数量发生明显变化,且其抗旱机制是多种蛋白质共同作用的结果,主要通过调节物质和能量代谢及应激活动来发挥作用.     

TcLr19PR1、TcLr19PR2和TaLr19TLP1的酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

在前期研究的基础上,将成功克隆得到3个病程相关蛋白PR1、PR2和PR5的序列,分别命名为TcLr19PR1、TcLr19PR2和TaLr19TLP1。将这3个基因分别连接到酵母双杂交诱饵载体pGBKT-7上,并转化到感受态菌株Y2HGold中,检测其毒性和自激活性。结果显示,成功构建了包含目的基因的诱饵重组载体pGBKT-7-TcLr19PR1、pGBKT-7-TcLr19PR2和pGBKT-7-TaLr19TLP1;将转化产物涂布于SD/-Trp/X平板上,生长良好,并出现阳性克隆;毒性检测中,将3个诱饵重组载体与空载体在SD/-Trp液体培养基中的生长情况进行对比,发现诱饵无毒性;自激活检测试验中,重组载体无法在二缺、三缺和四缺培养基中正常生长,证明诱饵无自激活性。因此,本研究成功构建的3个诱饵重组载体可用于3个PR蛋白互作蛋白的筛选,为进一步研究其在小麦与叶锈菌互作中的分子机理奠定基础。     

红鳍东方鲀FoxO1基因的原核表达及纯化

采集红鳍东方鲀脂肪组织提取其总RNA,采用RT–PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀FoxO1基因的ORF,并构建其原核表达载体p ET–32/FoxO1,在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达,通过IPTG诱导表达,对重组FoxO1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定,结果表明:重组质粒p ET32a/FoxO1被成功构建;用IPTG进行诱导表达,融合蛋白主要以可溶蛋白形式存在,能与抗His标签的兔多克隆抗体发生特异性反应;纯化出了融合表达蛋白,获得了相对分子质量约为110 000的重组蛋白。     

锌对5—15周龄鹅免疫、抗氧化功能、金属硫蛋白-Ⅰ基因表达量的影响及变量相关性分析

【目的】研究不同水平锌对5—15周龄鹅免疫抗氧化功能与金属硫蛋白-Ⅰ(MT-I)m RNA表达量的影响及相互关系,以科学地确定鹅饲粮中锌的需要量。【方法】试验随机选用29日龄体重相近的青农灰鹅360只(P0.05),设计6个处理,每处理6次重复,每重复10只(公母各半);各处理饲粮中锌水平分别为:27.46(Ⅰ组)、77.46(Ⅱ组)、127.46(Ⅲ组)、177.46(Ⅳ组)、227.46(Ⅴ组)、277.46(Ⅵ组)mg·kg-1(基础饲粮中含锌),试验进行11周。【结果】(1)胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数受饲粮中锌水平的影响,随锌水平的升高呈现先升高后降低趋势;当锌水平为127.46 mg·kg-1时,胸腺指数最高(P0.05);当锌水平为77.46 mg·kg-1时,脾脏指数、法氏囊指数最高(P0.05)。(2)饲粮锌水平为177.46 mg·kg-1时,鹅副黏病毒疫苗免疫后7日的抗体滴度最高(P0.05);饲粮锌水平为157.41 mg·kg-1时,鹅副黏病毒疫苗免疫后14日的抗体滴度最高(P0.05)。(3)当饲粮锌水平为153.84 mg·kg-1时,鹅血清和肝脏总抗氧化能力(T-AOC)活性最高(P0.01);当饲粮中含锌127.46 mg·kg-1时,血清和肝脏过氧化氢酶(CAT)活性最高(P0.01);当饲粮锌水平为148.33 mg·kg-1时,鹅血清和肝脏谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性最高(P0.05);当饲粮中含锌148.33 mg·kg-1时,血清和肝脏铜锌超氧化物歧化酶(Cu Zn-SOD)活性最高(P0.01);当饲粮中锌水平为177.46 mg·kg-1时,血清和肝脏中丙二醛(MDA)最低(P0.05)。(4)饲粮中锌能显著提高MT-I m RNA表达量(P0.05),当饲粮中锌水平为177.46 mg·kg-1时,肝脏MT-I m RNA表达量最高(P0.01)。(5)肝脏中MT-I m RNA表达量与肝脏中T-AOC(r=0.94)、Cu Zn-SOD(=r 0.97)活性指标呈极显著性正相关(P0.01),与CAT(r=0.85)、GSH-Px(r=0.89)活性呈显著正相关(P0.05),与MDA呈负相关(r=-0.70,P0.05);肝脏中MT-I m RNA表达量与血清中T-AOC(r=0.99)、CAT(r=0.92)和Cu Zn-SOD(r=0.94)活性均呈极显著正相关(P0.01),与GSH-Px呈正相关(r=0.81,P0.05),与MDA呈负相关(r=-0.39,P0.05)。【结论】(1)饲粮中适宜水平锌能够促进鹅免疫器官发育,增强T-AOC、CAT、GSH-Px、Cu Zn-SOD抗氧化酶活性,降低MDA水平。(2)饲粮中锌能够干预肝脏MT-I m RNA表达量,从而调节机体抗氧化能力。(3)鹅饲粮中锌水平在77—150 mg·kg-1范围内机体处于高位免疫和抗氧化状态。     

利用iTRAQ蛋白质组技术筛选与鸡喙畸形相关的候选蛋白

【目的】中国地方鸡种如北京油鸡、清远麻鸡存在喙畸形现象,表现为上下喙咬合不全,呈交叉状。严重影响鸡饮水和采食,从而影响个体发育和生产性能的发挥,造成一定经济损失。笔者根据喙畸形个体的系谱记录,发现喙畸形的形成受到遗传因素的影响,但具体机制尚不明确。蛋白是行使各种生物学功能的最终形式之一,喙畸形个体的发生可能是由于核心蛋白或者相关调控蛋白代谢异常造成的。利用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）技术以及生物信息学分析方法,筛选鸡畸形喙与正常喙中差异表达的蛋白,作为喙畸形相关的重要候选蛋白,为进一步研究北京油鸡喙畸形的遗传机制奠定基础。【方法】挑选3只120日龄喙畸形的公鸡作为试验组,编号为W1、W2、W3,同时,挑选与试验组个体为同胞关系（全同胞或半同胞）的喙正常公鸡作为对照组,编号为Z1、Z2、Z3。将喙畸形与其同胞正常个体作为一个比对组,iTRAQ试验具体包含3个比对组,即W1 vs Z1,W2 vs Z2,W3 vs Z3。屠宰个体后,剔除喙组织周围肌肉和筋膜,分离得到喙上颌骨和下颌骨,提取总蛋白样品,应用6个 iTRAQ标签标记各蛋白样品,经过色谱层析预分离,联合液相串联质谱分析,采用Mascot 2.3.02软件对蛋白进行鉴定和定量分析。试验组（W）与其同胞对照组(Z)样本比较（W1 vs Z1,W2 vs Z2,W3 vs Z3）,选择肽段数≥2,表达差异值＞1.2（上调）或＜0.83（下调）,且P＜0.05的蛋白作为差异表达蛋白。【结果】利用iTRAQ技术一共在喙组织中鉴定到3 372个蛋白,鉴定到的特异性肽段有12 769个。其中原鸡蛋白1 869个,分子质量主要分布在10-100 kD之间。3个比对组共鉴定出159个表达量有显著差异的蛋白质,其中包含70个表达上调的蛋白,89个表达下调的蛋白。统计各比对组蛋白表达差异值发现,表达量差异较大的上调蛋白质有LPL、MLC-2、CO9A1、MATN3、HSP90B1等,表达量差异较大的下调蛋白质有MBP、RLA1、PRVM、HAPLN1等。结合已经报道的这些蛋白的生物学功能,其中CO9A1、MATN3、HAPLN1与软骨合成和软骨骨化相关,CO9A1是带状软骨纤维的组成物质,MATN家族是非胶原性细胞外基质蛋白家族,HAPLN1是软骨细胞外基质的重要组成成分;PRVM是细胞内钙离子结合蛋白,参与调控Ca2+离子信号通路;LPL是多功能酶,主要在脂质代谢和转运过程中起作用,参与调控PPAR信号通路。初步筛选出CO9A1、MATN3、HAPLN1、PRVM、LPL作为与鸡喙畸形相关的候选蛋白。【结论】差异表达蛋白的发现为鸡喙畸形形态的发生提供蛋白质水平上的理论依据。     

3种作物纹枯病菌可溶性蛋白和酯酶同工酶的比较

为明确水稻、玉米和小麦纹枯病菌之间的生化差异,采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对这3种作物纹枯病菌(Rhizoctoniaspp.)18个菌株的可溶性蛋白和酯酶同工酶进行比较。结果发现,3种纹枯病菌的可溶性蛋白和酯酶同工酶图谱间均存在显著差异,其中可溶性蛋白图谱比酯酶同工酶图谱更具多样性。水稻和玉米纹枯病菌可溶性蛋白谱带有14~19条,而小麦纹枯病菌可溶性蛋白谱带7~9条;水稻和玉米纹枯病菌酯酶同工酶谱带有5~7条,而小麦纹枯病菌仅有3条,表明它们之间的差异是明显的。NTSYS聚类分析结果表明,水稻、玉米和小麦纹枯病菌菌株可溶性蛋白和酯酶同工酶谱带均具有丰富的多样性。