大肠杆菌表达系统及其研究进展

从表达量、表达活性、实验步骤的简化和成本控制4个方面综述大肠杆菌表达系统及其最新的研究进展。     

猪源ETEC的黏附素基因克隆与原核表达

[目的]克服传统方法制备黏附素抗原的缺点。[方法]应用PCR对猪源性产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)的黏附素F4、F5和F6的质粒中扩增出faeG、fanC和fasG基因片段,克隆测序并与pET 32a(+)构建重组表达载体。将重组表达载体转化E.coli表达菌株BL21(DE3),并分析其免疫原性。[结果]重组表达载体经IPTG诱导获得高效表达。血凝抑制试验表明,鼠抗血清能抑制标准的ETEC强毒株凝集红细胞,抑制效价在1∶128以上。这说明克隆表达的猪源ETEC黏附素蛋白具有良好的免疫原性。[结论]该研究可为进一步开发抗体制剂奠定基础。     

四川某规模化猪场仔猪腹泻病的诊疗体会

采用RT PCR方法,从四川某规模化猪场仔猪腹泻死亡病例病料中检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒,并分离细菌,最终鉴定为猪传染性胃肠炎继发大肠杆菌感染。药敏试验结果显示,分离的致病性大肠杆菌对林可霉素和氧氟沙星高度敏感。根据结果制定相应防治措施,经治疗处理后,病情得到有效控制。     

细菌毒力与细菌数量对鸡胚致死率的影响

将不同来源的鸡大肠杆菌梯度稀释后进行鸡胚致死率试验,探讨细菌毒力与细菌数量对鸡胚致死率的影响。结果表明,大肠杆菌菌数在100~1 000 CFU范围内,菌数与其致病力间相关性不显著(P0.05),鸡胚死亡率表现为菌株毒力的影响。     

大肠杆菌工程菌利用甘蔗糖蜜发酵产L-乳酸研究

大肠杆菌HBUT-L来源于HBUT-D,因此具有快速利用蔗糖的特性。对HBUT-L利用蔗糖及甘蔗糖蜜发酵产L-乳酸的特性进行了研究。结果表明,该菌株在96 h的发酵过程中,可将100 g/L的蔗糖转化生成60.0 g/L乳酸,转化率达到74.0%,杂酸产量少,具有工业化开发潜力。在玉米浆培养基中可以直接添加未经处理的甘蔗糖蜜,发酵周期持续224 h,发酵液所得乳酸产量为87.0 g/L,发酵液残糖为28.6 g/L,但乳酸产率极低,仅为0.389 g/(L·h),后续将对甘蔗糖蜜预处理工艺进行研究,进一步提高乳酸发酵速度和产量。     

球磨生物炭的性质及其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的毒性效应研究

为研究球磨生物炭的微生物毒性效应,采用元素分析、比表面积分析(BET)、扫描电子显微镜(SEM)及傅立叶红外(FTIR)表征等手段研究了500℃裂解小麦秸秆生物炭(BC)和球磨生物炭(BM)的性质,采用毒性暴露实验分析了不同浓度(0、10、20、50、100、200 mg·L~(-1))下两种生物炭对大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923的毒性效应。结果表明:BC的比表面积为98 m~2·g~(-1),而BM的比表面积提升到309 m~2·g~(-1),球磨可以增加生物炭中含氧官能团的数量;在0.9%NaCl溶液中,添加10 mg·L~(-1)的BM时,S.aureus存活率为90.1%,E.coli存活率为98.2%。当浓度增大到200 mg·L~(-1)时,S.aureus的存活率降低为23.5%,E.coli的存活率仍可达91.8%;而在LB培养基中,BM浓度为200 mg·L~(-1)时,S.aureus的存活率增加到58.1%;相同条件下,BM对微生物的毒性显著强于BC,这可能与粒子大小差异相关。而BM对革兰氏阳性菌S.aureus的毒性显著强于革兰氏阴性菌E.coli,这可能与E.coli产生的胞外聚合物(EPS)有关;添加活性氧自由基(ROS)消除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)发现,氧化损伤是造成S.aureus细胞死亡的主要原因,但是纳米颗粒对细胞的机械碰撞等其他因素也有可能是BM产生毒性的原因。研究表明BM对微生物具有一定的环境毒性效应,因此在BM使用过程中应注意其可能的环境影响。     

乳酸链球菌素及大黄组方对子宫内膜炎大鼠结肠的影响

为研究乳酸链球菌素(Nisin)及大黄组方对患子宫内膜炎大鼠生殖系统内分泌调控与结肠炎症因子的影响,进一步揭示子宫内膜炎与结肠之间的关系,构建子宫内膜炎模型,建模前后用ELISA试剂盒检测各组大鼠子宫中髓过氧化物酶(MPO)、催产素(OXT)和检测患子宫内膜炎大鼠结肠中白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)以及结肠菌群的变化情况来确定治疗效果。结果表明:1)造模前后,空白对照组中MPO和OXT的浓度无显著性差异;造模24h,Nisin组、大黄组方中和高剂量组中MPO的浓度显著降低;大黄组方高剂量组和阳性对照组中OXT的浓度显著高于阴性对照组和空白对照组,阴性对照组显著降低;造模48h,阴性对照组中OXT的浓度显著降低,且显著低于其他各组;造模72h,阴性对照组中MPO显著升高,OXT的浓度显著降低,大黄组方高剂量组和阳性对照组可显著降低子宫中MPO的浓度和显著增加OXT的浓度。2)在结肠中,患子宫内膜炎大鼠在0~72h阶段,阴性对照组中IL-1β和TNF-α的浓度显著升高,大黄组方高剂量组、Nisin组及阳性对照组中IL-1β和TNF-α的浓度显著降低。3)Nisin及大黄组方高剂量组显著增加结肠中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量,显著减少大肠杆菌和肠球菌的数量。研究发现Nisin和大黄组方高剂量组可降低子宫内膜炎大鼠子宫中MPO和OXT的浓度,患子宫内膜炎大鼠使结肠中IL-1β和TNF-α的浓度升高,Nisin、大黄组方高剂量组和阳性对照组可降低IL-1β和TNF-α的浓度,还可以调节结肠中菌群结构。     

中药复方制剂对大肠埃希菌多重耐药基因AcrA的影响

试验分别用精提和粗提的中药复方制剂"连黄"作用多重耐药的大肠埃希菌,提取其基因组DNA,并以大肠埃希菌AcrA的编码序列设计引物,成功扩增出AcrA基因中1 005bp大小的片段,与中药作用前的多重耐药基因AcrA的碱基序列进行对比分析.从分子生物学水平上探讨中药复方制剂时大肠埃希菌多重耐药基因AcrA的影响.结果表明.精提和粗提的中药复方制剂均能改变AcrA基因的编码序列,但精提制剂较粗提制剂对AcrA基因的影响更大.     

Nonphytate Phosphorus Requirement and Efficacy of a Genetically Engineered Yeast Phytase for Yellow Broilers at 22- to 42-d-Old Age

An experiment was conducted to investigate the requirement of nonphytate phosphorus (OP) and efficacy of a genetically engineered yeast phytase (PHY A) for Lingnan yellow broilers from 22- to 42-d-old age. A total of 1320 1 -d-old male chicks were randomly divided into 11 dietary treatment groups, which consisted of 4 replicate floor pens with 30 birds per pen.The control group (treatment 1) was fed with basal diet of nPP 0.08% without dicalcium phosphate or phytase supplementation. Dietary levels of nPP were 0.16, 0.24, 0.32, 0.40, 0.48, and 0.56%, respectively, for treatments 2 to 7,through addition of dicalcium phosphate (chemistry grade) to the basal diet. Diets of treatments 8 to 11 were supplemented with PHY A at 200, 400 and 600 U kg-t, a commercial phytase product (PHY B) at 400 U kg-1 level, respectively. The birds in 0.32-0.56% nPP groups gained more than those of the other groups (P<0.05). The nPP supplementation significantly improved feed intake (P<0.05). The feed gain ratio was significantly decreased by 0.40% nPP diet compared to the control birds (P<0.05). The level of 0.48% nPP was required for optimum tibia development. The additions of PHY A at 400 and 600 U kg-1 level and PHY B all significantly improved ADG (P<0.05), ADFI (P<0.05), and dry defatted tibia weight (P<0.05).Similarly, the percentage of tibia ash was increased by 600 U kg-1 PHY A supplementation (P<0.05). The requirement of nPP for maximal ADG and highest percentage tibia ash both was 0.40%. The phosphorus equivalency value of PHY A was estimated as 685 U kg-1 for male yellow broilers of 22- to 42-d-old age.     

规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征感染混合细菌研究

规模化猪场爆发急性高热病,采集死猪肺脏病料和血清5份用RT-PCR方法进行PRRSVNSP2基因扩增,3份为猪繁殖与呼吸综合征阳性,编号为scwhn01,scwhn02和scwhn03.对scwhn01 NSP2基因进行克隆和序列测定分析,有30个氨基酸的不连续缺失,与VR2332,JXA1,BJ-4,HuN4,CH-1a,HB-1(sh)2002和HB-2(sh)2002的NSP2的同源率在74.2%~91.0%之间,并从病料中分离到2株细菌,编号分别为SNC0901和SNC0902,均使被攻毒小鼠死亡.16S rDNA测序并在Genbank中blast鉴定为副猪嗜血杆菌和大肠杆菌.对所分离的细菌进行17种抗生素药敏实验,对头孢噻呋、头孢噻吩等敏感;对克林霉素、阿莫西林/棒酸等中度敏感;对荷兰、林可霉素、丁胺卡那霉素和土霉素等耐药.表明该猪场因高致病性蓝耳病病毒混合感染副猪嗜血杆菌、大肠杆菌导致猪大量死亡.