Characterisation and molecular basis of ALS inhibitor resistance in the grass weed Alopecurus myosuroides

Several UK populations of the grass weed Alopecurus myosuroides were identified where high proportions of individuals showed resistance to the acetolactate synthase (ALS)‐inhibiting herbicides, mesosulfuron‐methyl + iodosulfuron‐methyl sodium mixture and sulfometuron‐methyl. Screening with sulfometuron, followed by DNA sequencing of the ALS gene from resistant and susceptible individuals, led to the identification of eight populations where a single point mutation segregated with resistance to sulfometuron. All highly resistant individuals from seven of eight populations showed a single‐nucleotide polymorphism (SNP) in the first position of the Pro197 codon of an A. myosuroides ALS gene, conferring a predicted proline to threonine target‐site change. One population showed resistant individuals with single‐nucleotide polymorphism in the second position of the Trp574 codon, conferring a predicted tryptophan to leucine substitution. No other mutations segregating with resistance were found. Enzyme assays confirmed that resistance was due to an altered form of ALS enzyme, which was less susceptible to inhibition by sulfonylureas, making this one of the first fully characterised cases of ALS target‐site resistance in a European grass weed. Increased information regarding the nature and distribution of ALS target‐site mutation may help support sustainable management strategies, allowing continued use of mesosulfuron + iodosulfuron against this weed in the UK.     

CO2浓度增高对水稻籽粒淀粉代谢相关酶活性的影响

以高产优质粳稻松粳9号和稻花香2号为材料,利用开放式空气CO₂浓度富集系统（FACE）实验平台,研究CO₂浓度增高对水稻籽粒淀粉代谢相关酶活性的影响。试验设正常大气CO₂浓度（400±40μmol·mol-1）和高CO₂浓度（600±60μmol·mol-1）,测定开花后两个水稻品种籽粒中ADPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶和淀粉分支酶活性的变化。结果表明,CO₂浓度增高对不同灌浆进程中酶活性的影响程度有显著差异,对乳熟期之后ADPG焦磷酸化酶、可溶性和颗粒型淀粉合成酶活性的表达均有较明显的促进作用,仅阻碍了乳熟期籽粒中淀粉分支酶活性的表达;淀粉代谢相关酶活性对CO₂浓度增高的响应因品种而异,松粳9号籽粒中ADPG焦磷酸化酶活性受CO₂浓度增高的影响较大,而稻花香2号淀粉合成酶活性受其影响更大。说明随着灌浆进程的推进,CO₂浓度增高对淀粉生物合成途径中关键酶活性表达的影响程度存在明显的时段特征,且不同品种的响应程度有显著差异,总体来看,CO2浓度增高可在一定程度上促进淀粉代谢相关酶活性的表达。     

不同变种甜瓜糖分积累及蔗糖代谢酶活性动态变化

为了解不同类型甜瓜糖分积累及糖代谢特点,选用厚皮甜瓜品种X228、普通甜瓜品种B154及越瓜品种H227为材料,定期取样测定果实成熟过程中的葡萄糖、果糖、蔗糖含量和蔗糖代谢相关酶活性,研究不同变种甜瓜果实发育过程中糖分积累及相关酶动态变化差异。结果表明,授粉15 d至果实成熟期间,3个甜瓜品种的果实葡萄糖与果糖含量的变化均较小,品种间差异不显著。3个甜瓜品种果实蔗糖含量存在显著性差异,其中H227果实几乎无蔗糖积累,葡萄糖和果糖是果实的主要糖组分;B154和X228果实蔗糖含量随着果实发育而快速增加,蔗糖积累存在明显的转折点,蔗糖是B154和X228这2个品种成熟果实中最主要的糖组分,且果实蔗糖含量提高的同时蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性上升、酸性转化酶(AI)活性降低,蔗糖合成酶(SS)合成方向的活性与蔗糖含量关系不显著。根据蔗糖含量的差异,可将甜瓜分为蔗糖积累型和低蔗糖积累型两类,前者果实蔗糖含量的上升被认为是SPS活性上升与转化酶(特别是AI)活性下降共同作用的结果,后者果实内极低的蔗糖含量被认为是SPS活性较低导致的。本研究结果为甜瓜种质资源创新利用和甜瓜果实糖分积累调控研究奠定了理论基础。     

肺炎克雷伯氏菌S001草甘膦靶标酶基因的克隆及其抗性验证

【目的】由于草甘膦在农业生产中的广泛使用,抗草甘膦转基因作物的研究一直是转基因作物研究的热点,其中草甘膦抗性功能新基因的挖掘是核心问题。自然界中微生物种类繁多,基因资源丰富,论文拟从广东地区农田土壤中筛选和鉴定出高抗草甘膦菌株,克隆其草甘膦靶标酶基因并进行抗性水平验证,以期获得高抗草甘膦新基因资源用于抗草甘膦转基因作物的研究。【方法】用含有浓度梯度草甘膦的选择培养基从备选土壤中筛选出具有高抗草甘膦特性的菌株;通过显微观察、革兰氏染色以及16S rDNA序列分析结果对菌株种类进行鉴定;利用RT-PCR技术克隆该菌株的草甘膦靶标酶基因aroAS001,并通过序列比对和系统发育树分析aroAS001序列的基本特征;利用重叠 PCR法对aroAS001变异位点进行定点突变获得aroAS001-mut序列后,将aroAS001和aroAS001-mut基因片段转入aroA基因缺陷型菌株DH5α/△aroA中进行基因功能互补和草甘膦抗性水平验证。【结果】分离出一株高抗草甘膦菌株,经形态学和分子生物学鉴定该菌株为肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）,命名为kpS001;克隆该菌株草甘膦靶标酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）基因aroAS001,序列分析结果显示由该基因所编码的氨基酸序列具有典型的Class I EPSPS特征,但与已报道肺炎克雷伯氏菌的aroA相比其第227位碱基发生突变,致使对应的氨基酸发生变异。对该基因差异位点进行核酸定点突变获得aroAS001-mut基因片段后,将aroAS001和aroAS001-mut基因片段分别转入缺陷型大肠杆菌菌株DH5α/△aroA进行功能互补验证,与对照菌株相比,转入aroAS001和aroAS001-mut的重组菌株均能在含200 mmol?L-1以下浓度草甘膦的培养基中能够正常生长,表现出良好的抗性,之后随着草甘膦浓度增加其生长状态开始受到抑制,当草甘膦浓度达到350 mmol?L-1时,菌株生长基本完全被抑制。【结论】肺炎克雷伯氏菌kpS001菌株是一株高抗草甘膦菌株,由aroAS001编码的草甘膦靶标酶EPSPS属于Class I EPSP合成酶,aroAS001对草甘膦具有优良抗性,能在含350 mmol?L-1以下浓度草甘膦的培养基中生长,该基因可以作为备选基因资源用于抗草甘膦转基因作物的研究。     

茉莉花香气相关基因JsDXS及其启动子的克隆与表达分析

以双瓣茉莉花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术相结合的方法,获得茉莉花香气形成限速酶即5–磷酸脱氧木酮糖合成酶（Deoxyoxylulose-5-phosphate synthase,DXS）基因（命名为JsDXS）;采用染色体步移技术获得该基因的启动子序列;采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在花瓣发育过程中的表达动态。结果表明,JsDXS全长cDNA 为2 505 bp,其中ORF（Open Reading Frame）为2 145 bp,编码714个氨基酸,含有TPP-DXS、TPP-PYR-DXS-TK-like和Transketolase C等保守功能结构域;分离得到JsDXS基因上游调控序列745 bp,其含启动子核心元件TATA-box及T/GBOXATPIN2（茉莉酮酸酯相关元件）、CIACADIANLELHC（生物钟相关元件）、MYCCONSENSUSAT（低温相关元件）等与花香形成相关的重要顺式作用元件;荧光定量PCR分析表明,该基因在18：00时表达量较低,随着时间的推移逐渐上调,到夜间22：00时表达量达到最高,逐渐又出现下调的趋势,直至凌晨2：00时表达量降到最低,说明该基因的表达受生物钟的控制。     

糖原合成激酶抑制剂在胚胎干细胞自我更新中的作用

胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)是从早期囊胚内细胞团分离培养出来的能够不断维持自我更新和具有发育多能性的细胞。Wnt信号通路在维持胚胎干细胞的自我更新方面起着重要作用,糖原合成激酶 (glycogen synthase kinase-3,GSK-3)抑制剂可以激活Wnt信号通路,促进胚胎干细胞自我更新和增强细胞间连接。作者就GSK-3抑制剂在胚胎干细胞自我更新、细胞连接方面的作用及其作用机制进行简单综述。     

菜用大豆籽粒不同部位蔗糖积累及关键酶活性研究

田间种植可溶性糖含量不同的3个菜用大豆品种,在R5.5、R6、R6.2、R6.5和R7期取样,分析籽粒种皮、子叶和胚轴中蔗糖含量及4种关键酶活性动态,结果表明,籽粒不同部位蔗糖积累呈先增加后下降的趋势,R6.2期是高峰期,此时期品种台292、中科毛豆1号和品系121的胚轴蔗糖含量比子叶分别高57.6%、53.6%和44.2%;比种皮分别高71.6%、75.3%和73.6%。由于子叶干重占整粒重90%以上,因此整个籽粒的蔗糖含量主要由子叶决定。子叶的蔗糖磷酸合酶(SPS)活性高于胚轴和种皮,在R6.2期表现更加明显,且蔗糖含量高的品系121子叶中SPS活性高于另外2个品种;蔗糖合酶(SS)在籽粒形成期活性变化呈前期高于后期的趋势,最高值出现在灌浆前期R5.5期胚轴中;两种转化酶活性变化差异较大,中性转化酶(NI)活性一直呈不断下降趋势;籽粒不同部位NI活性无明显差异,而酸性转化酶(AI)活性差异较大;胚轴和子叶中AI活性明显低于种皮,且种皮中AI活性与种皮中蔗糖积累显著负相关(r=–0.59)。蔗糖积累与4种关键酶活性的相关分析发现,籽粒中蔗糖的含量并非受某一种酶绝对调控,SPS活性与SS+AI+NI活性总和之差与籽粒中蔗糖的积累显著正相关(r=0.53^**)。     

赤霉素生物合成酶基因GhCPS和GhKS参与甲哌鎓对棉花幼苗叶片生长的控制

室内盆栽欣抗4,在棉花幼苗第3片真叶完全展平时(第4叶未展开)叶面喷施甲哌鎓(DPC),研究DPC对棉花幼苗叶片生长的控制与赤霉素(GA)合成早期关键酶柯巴基焦磷酸合酶(CPS)和内根-贝壳杉烯合酶(KS)基因表达的关系。结果表明,DPC处理显著减小棉花幼苗第3和第4叶的叶面积,第4叶叶面积受控制程度较第3叶大;80 mg L^–1DPC处理的棉花幼苗第3和4叶中GA₄含量分别于处理后4 d和4~6 d显著低于对照;与对照相比,80 mg L^–1 DPC处理的棉花幼苗第3叶中GhCPS和GhKS表达在处理后1~4 d显著降低,而第4叶中GhCPS和GhKS的表达在处理后1~6 d显著降低。由此可见,DPC通过影响GhCPS和GhKS的表达,降低内源活性GA₄的含量,控制棉花幼苗叶片生长,且较幼嫩叶片对DPC较敏感。     

不同氮素水平对甜菜氮代谢酶和可溶性蛋白含量的影响

为了筛选合适的氮素施用量,研究氮素营养和氮素同化关键酶的关系,以尿素为氮源,采用HI003为试材,研究了不同的施氮水平对甜菜叶片、块根中可溶性蛋白含量、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的影响。结果表明：叶片中,硝酸还原酶的活性随着施氮水平的提高而增加,但是超过 200 kg/hm²酶活性下降;块根中硝酸还原酶活性在0~120 kg/hm²随着施氮量增加而上升,超过 160 kg/hm²酶活力下降。叶片、块根中,整个生育期施氮肥处理增加了谷氨酰胺合成酶活性。试验中发现施氮量和生育期早期的叶片中硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性呈显著正相关。施氮量和甜菜叶片可溶性蛋白含量在7月15日和9月15日呈显著正相关;在生育期内,氮素水平和块根中的可溶性蛋白含量呈极显著正相关。