杂交构树叶多酚提取工艺优化及其抗氧化活性研究

为建立和优化杂交构树叶多酚的提取工艺,本试验采用超声波辅助提取的方法,以构树叶多酚得率为考察指标,通过单因素试验研究液料比、乙醇浓度、超声时间、超声温度4个因素对构树叶多酚得率的影响;在单因素试验的基础上,借助响应面法设计4因素3水平的试验方案,对构树叶多酚提取的工艺参数进行优化,建立回归模型并进行响应面分析,最终确定最佳的提取工艺参数,并进行3次平行验证;以维生素C为对照,通过测定构树叶多酚对DPPH和ABTS自由基的清除率,评价构树叶多酚的体外抗氧化活性。结果显示：4个因素对构树叶多酚得率的影响顺序依次为：乙醇浓度（B） > 液料比（A） > 超声温度（D） > 超声时间（C）,响应面分析结果显示：两两因素之间存在交互作用,但交互作用不显著（P>0.05）;在液料比为70：1、乙醇浓度为60%、超声时间为50 min、超声温度50 ℃的条件下,构树叶多酚的得率最大,为13.62 mg/g,与响应面法的预测值接近;体外抗氧化试验结果表明,构树叶多酚可以清除DPPH和ABTS自由基,并且在高浓度情况下可以达到与维生素C相当的水平。综上,试验建立的构树叶多酚提取工艺准确、可行,同时证明构树叶多酚具有良好的抗氧化活性;该结果可为构树叶多酚的生物活性研究以及构树叶的药用价值开发提供参考。     

绵羊BMP15基因B2突变可视化检测技术的建立

骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15,BMP15）基因突变对绵羊排卵率、产仔数以及繁殖力有很大影响,本研究旨在建立快速可视化检测BMP15基因B2突变的技术。将改良的扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS）与核酸染料SYBR Green Ⅰ结合,针对BMP15基因B2突变设计ARMS特异性引物,使引物下游3'端的最后一个碱基为A,并在下游引物3'端的第3位碱基处设计额外的错配,以提高引物的特异性;经ARMS PCR扩增后,向产物中加入SYBR Green Ⅰ,通过肉眼观察PCR管内的颜色变化来检测BMP15基因的B2突变。经测序发现所采集的样本均为野生型,因此,利用重叠延伸PCR构建BMP15基因B2突变型模板,测序结果显示BMP15基因B2突变型模板构建成功。ARMS PCR结果显示,ARMS特异性引物能够只扩增突变型模板,而不会扩增野生型模板,且扩增效果良好。ARMS PCR扩增后加入SYBR Green Ⅰ发现已知野生型模板与阴性对照一致,呈SYBR Green Ⅰ原始颜色橙黄色,而已知突变型模板呈亮绿色,且色差明显,肉眼可辨。用建立的可视化检测BMP15基因B2突变的技术检测50个小尾寒羊基因组DNA （随机向其中20个样本中加入构建的BMP15基因B2突变型模板）,将可视化检测的突变型样本编号与混合样本时记录的编号对比,结果表明该技术能够准确检测绵羊BMP15基因的B2突变,且准确率高达100%。将构建的BMP15基因B2突变型的模板进行梯度稀释,对本试验可视化检测体系的灵敏度进行检测,发现ARMS可视化检测技术的灵敏度达到0.006 ng/μL。因此,本研究建立的技术能够可视化地检测绵羊BMP15基因B2突变,且准确率高,有望为高繁殖力绵羊的选育提供技术支持。     

气肿疽梭菌CctA基因的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

研究旨在原核表达气肿疽梭菌细胞毒素A （CctA）基因,用纯化的重组蛋白建立其间接ELISA检测方法,a。利用大肠杆菌密码子的偏爱性优化CctA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a （+）,双酶切鉴定原核表达质粒pET28a-CctA并测序。将重组质粒转入大肠杆菌,经IPTG诱导得到高表达的重组CctA包涵体蛋白。包涵体蛋白变性后经镍（Ni）柱纯化,SDS-PAGE检测其纯化效果。以豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清为一抗,用Western blotting方法检测重组CctA蛋白的反应原性。用棋盘滴定法建立间接ELISA检测方法,以复性后的重组CctA蛋白作为检测抗原,摸索抗原包被浓度、封闭液的种类及浓度、抗体的最适稀释度和反应条件等。选用3批气肿疽灭活疫苗免疫豚鼠后采集血清,同时用攻毒和间接ELISA两种方法验证疫苗的免疫效力。质粒双酶切结果显示,得到大小约853 bp的条带,与预期相符,且测序结果正确。SDS-PAGE结果表明,成功表达并纯化大小为35 ku的重组CctA蛋白。Western blotting结果显示,豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清与重组CctA蛋白具有良好的反应原性。建立的间接ELISA法的最适条件为：抗原的包被浓度为0.5 μg/mL,于4 ℃包被过夜;封闭液选择10%胎牛血清,37 ℃孵育2 h;二抗的稀释度为1：8 000;室温避光显色10 min后终止反应,测定D_{450 nm}值。当P/N>4.6时,间接ELISA法检测结果与豚鼠攻毒试验结果拟合度较好。本研究成功表达CctA基因并纯化了重组CctA蛋白,建立的以重组CctA蛋白为检测抗原的间接ELISA检测方法,有望成为气肿疽灭活疫苗免疫效果验证的替代方法。     

2020年新疆地区规模化猪场猪PCV2抗体检测与分析

为了解新疆地区2020年规模化猪场猪圆环病毒2型的免疫抗体水平,选择新疆地区6个规模化猪场,针对不同日龄段的猪采集血清样品333份,采用猪圆环病毒2型ELISA抗体检测方法进行抗体检测分析。结果发现,2020年新疆地区规模化猪场猪圆环病毒2型平均抗体阳性率为77.78%（259/333）,平均抗体阳性率符合国家标准。但各猪场免疫效果参差不齐,抗体阳性率最高的为A场,阳性率达100.00%;阳性率最低的为C场,仅48.78%,低于（70%）的国家标准。不同日龄段的猪抗体水平也存在一定的差异,抗体阳性率最高为种公猪,达96.30%;而保育阶段猪抗体水平最低,仅有47.92%,低于国家标准。     

基于标记的极半径极值红枣形状识别方法

形状是分级的最重要参数之一,本文采用标记法对红枣形状进行了识别。通过图像预处理获取红枣二值图像,通过边界追踪获取目标边界笛卡尔坐标,并将其转化为极坐标,对目标图像进行缩放旋转使均值圆成为基线,切割的4部分边界曲线能完整表达。对边界曲线进行多项式拟合,获取极值点坐标,将其映射回被拟合曲线上,获取对应极值点坐标。若两极小极半径差值大于阈值,则红枣畸形;若两极大极半径附近区域极半径过渡平缓,判红枣为规整,否则为较规整。取53粒红枣进行检测,其中16粒畸形,17粒较规整,20粒规整。检测结果表明:畸形枣识别准确率达100%,较规整枣的识别准确率94%,规整枣识别准确率95%,可基本满足红枣分级系统精度的要求。     

Establishment and Application of a Multiplex RT-PCR Assay for Detection of PEDV,TGEV and PRoV

In this study,a multiplex RT-PCR assay was established to differentially detect porcine epidemic diarrhea virus (PEDV),porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine rotavirus (PRoV) after optimization of the reaction conditions.Three pairs of primers PEDV-N,TGEV-M and PRoV-VP6 were designed for specifically amplifying PEDV N gene,TGEV M gene and PRoV VP6 gene,respectively.The assay could specifically amplify PEDV,TGEV and PRoV,but not classical swine fever virus (CSFV),porcine foot and mouth disease virus (FMDV),pseudorabies virus (PRV),porcine parvovirus (PPV) and porcine circovirus type 2 (PCV2).The detection limits of PEDV,TGEV and PRoV standard recombinant plasmids were 1.41×10³,1.41×10² and 1.41×10³ copies/μL,respectively.The repeated reaction under the same conditions obtained uniform results.The assay was used to detect a total number of 190 clinical samples,of which 42 (22.11%) samples were positive for PEDV,58 (30.53%) samples for TGEV and 34 (17.89%) samples for PRoV,and there were mixed infection among these viruses.The results indicated that this multiplex RT-PCR assay had the advantages of sensitivity,specificity and repeatability and provided a useful tool for differential detection and epidemiological investigation of PEDV,TGEV and PRoV.     

鸡毒支原体研究概况

鸡毒支原体(MG)是对养禽业危害很大的支原体,主要导致禽类慢性呼吸道疾病(CRD),以禽的结膜炎、产蛋率及饲料转换率下降、屠宰率下降等为主要特征。MG可通过垂直和水平传播方式在鸡群中传播,每年给全球家禽产业带来巨大经济损失。随着对MG细胞表面抗原黏附素蛋白(pMGA)和PvpA、GapA的结构与功能研究的深入,K株、TG5株等MG疫苗研究也取得较大进展。由于抗生素的滥用,MG基因中也发生耐药突变,产生了QRDRs等抗药结构,导致MG在耐药性上也出现新的特点。论文主要对国内外MG的疫苗开发、耐药情况和检测技术等进行综述,旨在对家禽MG的综合防控提供借鉴。     

响应面法优化杜仲叶提取物的制备工艺

优化杜仲叶提取物制备的工艺条件,在单因素试验基础上,以杜仲叶提取物浸膏得率和绿原酸转移率为评价指标,采用Box-Behnken中心组合设计法优化杜仲叶提取物制备的工艺条件。杜仲叶提取物制备的最佳工艺条件为乙醇浓度500mL/L,液料比10∶1(mL/g),提取温度97℃,提取4次,每次30min;在此最佳工艺条件下,杜仲叶提取物浸膏得率和绿原酸转移率综合评分均值为99.08,与预测值基本一致。响应面法(RSM)优化的杜仲叶提取物制备工艺稳定可靠。