阿维链霉菌aveC基因缺失对产素调控的影响

通过构建仅含有aveC基因两端交换臂的缺失载体,与阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)染色体中aveC基因发生同源重组,以阻断该基因,从而获得aveC缺失突变株。并经摇瓶发酵和高效液相色谱检测不同阿维菌素组分产量。结果显示,aveC缺失突变株的阿维菌素的总产量与出发菌株的总产量差异不显著;而阿维菌素组分1的产量下降约58%,组分2的产量提高约52%。     

伪狂犬病病毒PK基因的克隆与PK、gG双缺失转移载体的构建

地高辛标记伪狂犬病病毒（PRV）Ea株短区段蛋白激酶（PK）基因3′端0．4kb片段，Southern杂交确定短区段PK基因定位在基因组DNA BamH Ⅰ 4．0kb片段中。将该片段克隆获得重组质粒pSB304，对pSB304亚克隆，构建了仅含完整PK基因约1．3kb片段的重组质粒pSB305，并进行了序列测定。结果表明，PK基因存在2种可能的同框编码方式，分别编码388或334个氨基酸残基，并具有真核细胞蛋白激酶催化结构域序列。同国外PRV NIA-3、Ka株相比，氨基酸同源性分别为98．8％和97．3％，有意义的是Ea株、Ka株均较NIA-3株在同一位置缺失2个氨基酸（Asp，Gly）。进一步对pSB305和含gG全基因以及部分gD基因的质粒pUSK进行酶切拼接，将PK基因大部分编码区、gG基因5′端部分编码区进行缺失，构建成两端同源侧翼分别为3．1kb和1．6kb的PK、gG双缺失转移载体pLR001。上述结果为深入研究PK基因功能及研制更安全的TK^-／PK^-／gG^-三缺失基因工程疫苗奠定了基础。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NM1株全基因测序及致病性分析

从内蒙古自治区暴发猪“高热病”的猪场分离出1株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（ Highly pathogenicporcine reproductive and respiratory syndrome virus, HP-PRRSV）,命名为NM1株。根据GenBank上已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）全基因序列设计引物进行RT—PCR扩增和序列测定,结果表明HPPRRSVNM1株基因组全长15356bp（包括PolyA尾）。分析结果显示该毒株与PRRSV美洲型标准株（VR-2332）和欧洲型标准株（LV）全基因核苷酸同源性分别为89．4％和61．9％,说明NM1属于美洲型毒株。与VR-2332相比,NM1株非结果蛋白（nsp2）第481位和第533～561位氨基酸存在缺失,该毒株属于PRRSV变异株。动物接种试验结果表明,该毒株对猪具有高致病性。     

利用Red重组系统敲除大肠杆菌菌株ClpP基因方法的研究

为了研究ClpP基因的功能,试验利用Red系统的重组功能,通过PCR扩增出两端与大肠杆菌菌株ClpP基因上、下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因cat的DNA片段,电击转化含质粒pKD46的大肠杆菌菌株DH091,筛选替换ClpP基因的阳性转化子,再导入质粒pCP20去除氯霉素抗性基因。结果表明:成功敲除大肠杆菌菌株ClpP基因。     

缺失外壳蛋白羧端155-158序列对TMV侵染性的影响

对野生型TMV—U1的外壳蛋白羧端进行缺失突变,观察到外壳蛋白羧端序列缺失4个氨基酸（即外壳蛋白保留154个氨基酸）的TMV154TAG能较强地系统侵染烟草,并高水平表达外壳蛋白,经过二次转接新烟草植株仍保持较强的系统侵染状况,复制完整病毒粒子。结果说明外壳蛋白羧端序列4个氨基酸序列的缺失对烟草花叶病毒感染和复制无严重影响,对利用外壳蛋白羧端缺失型病毒载体表达外源多肽技术具有一定的应用价值。     

糖基翻转酶gtcA基因缺失降低单增李斯特菌1/2a血清型菌株致病性的研究

【目的】 构建糖基翻转酶gtcA基因缺失株，并阐明其对单增李斯特致病性的影响。【方法】 利用同源重组技术构建gtcA基因缺失株；进一步分析亲本株EGDe-prfA*、缺失株ΔgtcA和回补株CΔgtcA的生长能力；通过Western blotting分析gtcA基因缺失对InlA和InlB在细菌表面锚定的影响；通过DF1细胞黏附侵袭试验、RAW264.7细胞吞噬增殖试验和鸡胚毒力试验评估gtcA基因缺失对单增李斯特菌细胞侵染能力及对鸡胚致病性的影响。【结果】 生长曲线显示，gtcA基因缺失并不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力。Western blotting结果显示，内化素InlB在ΔgtcA表面的锚定量极显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA（P<0.01），但其表面InlA的锚定量与EGDe-prfA*并无显著差异（P>0.05）。细胞黏附侵袭试验结果显示，ΔgtcA对成纤维细胞DF1的平均黏附率和侵袭率显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA（P<0.05）。吞噬试验结果显示，巨噬细胞RAW264.7对ΔgtcA的平均吞噬率显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA（P<0.05），但ΔgtcA与EGDe-prfA*、CΔgtcA在RAW264.7中的3 h内增殖倍数并无显著差异（P>0.05）。鸡胚毒力试验结果显示，ΔgtcA感染鸡胚肝脏和脾脏中的平均细菌载量分别为6.86×10³和3.69×10² CFU，极显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA感染鸡胚（P<0.01）；同时，ΔgtcA感染鸡胚存活率及存活时间均高于EGDe-prfA*和CΔgtcA感染鸡胚。【结论】 糖基转移酶gtcA基因缺失不影响单增李斯特菌1/2a血清型菌株EGDe-prfA*的生长能力，但能显著降低该菌表面InlB的锚定丰度，减弱该菌的细胞侵染能力及对鸡胚的致病性。本研究结果为深入探索糖基翻转酶基因gtcA介导单增李斯特菌致病机制提供参考。     

流产布鲁氏菌2308株磷酸甘露糖变位酶pmm基因缺失株构建及鉴定

旨在构建流产布鲁氏菌2308株pmm基因缺失株。PCR扩增流产布鲁氏菌2308株pmm基因的上、下游同源臂片段,并与枯草芽孢杆菌上SacB基因片段融合。连接至自杀载体PGEM-7Zf+,构建自杀载体PGEM-7Zf+Δpmm-SacB。电转化至流产布鲁氏菌2308株感受态细胞内,通过氨苄抗性和蔗糖敏感性筛选,获得基因缺失株2308Δpmm,对其进行PCR鉴定和稳定性检测。成功构建可稳定遗传的2308Δpmm基因缺失株,并在15代内未发生回复。在此基础上可以对2308Δpmm进行深入研究。