紫外光和蓝光调控查尔酮合成酶基因表达的研究

UV-B（280nm～320nm）、UV-A（320nm～390nm）和蓝光（390nm-500nm）经不同光受体和信号传递途径控制植物发育的各个方面。已知的蓝光／UV-A受体有隐花色素CRY1和CRY2，向光性受体有趋光素。氧化还原过程在隐花色素和趋光素信号转导过程中起重要作用。专一的UV-B光受体尚未被鉴定出，存在许多可能的UV-B信号传递途径．拟南芥查尔酮合成酶（CHS）的紫外光和蓝光转录调控成为研究热点。光受体突变体实验表明存在不同的UV-A／蓝光和UV-B光感知系统调控CHS的表达。拟南芥细胞悬浮培养物实验表明UV-B和CRY1信号传递途径在动力学上和药理学上不同。影响诱导CHS转录的启动子元件和转录因子现已被鉴定出。UV-B、隐花色素和光敏色素信号传递途径之间的相互作用调控CHS表达。UV-B途径与UV-A／蓝光途径的协同相互作用使CHS最大量表达。另外，专一的光敏色素经不同的增强和相巨作用正调控CRY1途径，负调控UV-B途径。     

枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的克隆与表达分析

为探究枸杞查耳酮异构酶CHI1基因在不同组织中的表达模式和功能,利用同源克隆的方法获得1个枸杞（Lycium chinense）LcCHI1基因（Genbank No. OR026273）,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,利用荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对其组织表达的特异性进行分析,并进行原核表达分析。结果表明：1）枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的cDNA序列全长695 bp,开放阅读框为633 bp,编码210个氨基酸,含有１个保守的Chalcone_3 family结构域。2）氨基酸序列比对显示,LcCHI1蛋白符合Chalcone蛋白结构特征且与其他物种Chalcone蛋白具有高度的相似性。聚类分析表明,LcCHI1蛋白与茄科的CHI蛋白单独聚成一支。3）LcCHI1在枸杞花、嫩叶与嫩枝中表达量较高,在根中表达量较低。随着枸杞果实的发育,LcCHI1表达呈先升高后降低趋势,在变色果中表达量最高。4）在原核表达载体中构建LcCHI1重组蛋白,经SDS-PAGE电泳分析在63 ku处出现表达蛋白。综上,LcCHI1基因在枸杞花和变色果中表达较高,并能进行原核蛋白表达,研究结果为枸杞类黄酮合成途径中CHI基因的功能验证奠定基础。     

香樟IDI基因克隆及表达分析

为了克隆香樟异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)基因,并进行生物信息学分析,为香樟植物萜类化合物的生物合成研究提供基础。本研究以香樟植物为试样,在转录组测序数据的基础上设计引物,应用RT-PCR技术克隆香樟IDI基因,通过实时定量PCR方法检测IDI基因在香樟根、茎和叶中表达量,利用生物信息学方法对IDI基因编码的蛋白进行表征。结果表明,香樟IDI基因长度868 bp,开放读码框(ORF)为708 bp,编码235个氨基酸,编码蛋白的分子量为27.04 kD,等电点为5.13,蛋白的二级序列结构主要为α-螺旋。经预测香樟IDI是一个定位于细胞质,不含信号肽的亲水性稳定蛋白,具有异戊烯基焦磷酸异构酶的特征结构域。系统进化树分析表明,香樟IDI与野生型马来西亚蕉的亲缘关系较近。实时定量PCR结果表明,IDI在香樟茎中的表达量高于根和叶。本研究成功从香樟中克隆了IDI基因并进行了表征分析,为深入研究香樟IDI基因在萜类合成中的功能提供帮助。     

PMI/甘露糖筛选体系在植物转基因中的应用

介绍了一种可在植物转基因中应用的新型筛选方法———磷酸甘露糖异构酶(PMI)法,与传统筛选体系不同,它以甘露糖为筛选剂对转化细胞进行正筛选。PMI能将甘露糖- 6 -磷酸转化成果糖- 6 -磷酸,使转化细胞以甘露糖为唯一或主要碳源而正常生长;非转化细胞由于不能利用甘露糖而停止生长。该筛选体系受基因型、培养基中其他糖和磷酸根离子浓度及培养条件等因素的影响。目前已应用于多种模式植物和经济作物的转基因筛选,在木本植物甜橙上也首获成功。其检测方法多样,除了常规转基因检测方法外,还可对酶活性进行检测,其中氯酚红法简单可靠,且无需昂贵试剂。安全评估结果表明PMI基因对人体健康和环境无害。PMI/甘露糖筛选体系有望成为植物转基因的又一有效筛选手段。     

Interspecific crosses between Pelargonium×hortorum and P. quinquelobatum using embryo rescue and molecular characterization of hybrids by an endogenous chs probe

Interspecific hybridizations were performed between pelargonium × hortorum (subgenus Ciconium) and a yellow-flowered species. Pelargonium qitinquelobatum(subgenus Eumurpha). Hybrids, using embryo rescue, were obtained only when P. quinquelobatum was used as the female parent. A polymerase chain reaction (PCR) cloned Pelargonium chs gene fragment was used as probe to characterise hybrids hy restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis. Chromatographic flavonoid analysis showed that hybrids could synthesize both flavonol glycosides and anthocyanin in the petals which were pale yellow to pale pink from the proximal to the distal part.     

大黄欧文氏菌蔗糖异构酶控制产物特异性基序的定点突变

大黄欧文氏菌（Erwinia rhapontici）蔗糖异构酶催化蔗糖异构为异麦芽酮糖和海藻酮糖,具有一个可能控制产物特异性的325RLDRD329基序。本研究以定点突变方法对该基序的带电荷氨基酸进行突变,共构建R325D、R328A、R328D、R328Q和D329N5个突变体。通过对突变体的酶学特性及突变体转化蔗糖的产物组成分析,结果显示所构建突变体的Km值上升约2～5倍,比活力下降至野生型SI比活力的11.8%～25.3%。HPLC分析显示Arg325和Arg328分别突变为Asp,导致产物中异麦芽酮糖/海藻酮糖的比例从6.93分别降至0.96和2.92,并伴随一个未知寡糖出现。Arg328突变为Ala和Gln同样导致反应产物中海藻酮糖比例上升,异麦芽酮糖比例下降。但是突变体D329N反应产物比例没有变化。以上结果表明325RLDRD329基序对大黄欧文氏菌蔗糖异构酶的酶活具有重要作用,并对酶的产物特异性产生影响。本研究结果将为该酶的作用机理研究奠定基础。     

草菇gpi基因结构及其异核体表达协同增效作用

以草菇(Volvariella volvacea)单孢菌株PYd21(基因组测序菌株)和PYd15(基因组重测序菌株)为材料,配对获得可正常出菇的异核菌株H15-21.克隆测序了PYd21和PYd15的葡萄糖-6-磷酸异构酶基因(gpi),并对基因的结构和表达谱的表达量进行分析.结果表明,PYd21和PYd15的gpi基因序列相同;转录组reads定位、paired-end分析结果显示,gpi基因全长2404 bp,ORF全长1659 bp,编码552个氨基酸,含有8个外显子、7个内含子,5'UTR长度为101 bp、3'UTR为183 bp,RNA加工过程中有2种可变剪切类型、3个可变剪接位点;表达谱测序结果,PYd21、H15-21和PYdI5 gpi基因的表达量分别为84.53、1079.31和270.95TPM,草菇gpi基因表达表现出异核体表达协同增效作用,暗示着异核菌株中的2种不同来源的细胞核可能存在相互作用,这一结果在实时荧光定量PCR检测后得到证实.     

以木糖异构酶基因作为选择标记的花生遗传转化

用木糖异构酶基因xylA替换掉pCAMBIA1301中的潮霉素磷酸转移酶基因(hygromycin-B-phosphotransferase,Hpt),构建了植物表达载体pCAMBIA1301-xylA。再利用农杆菌介导法将pCAMBIA1301-xylA导入花生,转移到添加蔗糖(5g/L)和不同浓度木糖(5,10,20,30g/L)的体胚诱导及体胚萌发培养基上培养。对外植体成苗率及转基因阳性率进行统计,结果表明,当木糖浓度为10g/L时,诱导成苗率为15.25%,再生植株生长健壮,且转基因阳性率高达77.27%,最终确定10g/L为最适木糖筛选浓度。该筛选方法利用木糖作为筛选剂,可以避免利用抗生素筛选可能造成的安全隐患,转化效率高,是一种安全、高效的筛选方法。     

甘蔗β-胡萝卜素异构酶基因家族的鉴定、定位和表达分析

独脚金内酯(strigolactones, SLs)是一种广泛存在、能够抑制植物分蘖或分枝的植物激素。β-胡萝卜素异构酶(D27)是SLs合成中的关键酶,但是目前关于甘蔗D27基因家族的鉴定与分析鲜有报道。本研究通过挖掘甘蔗原始亲本之一的割手密种基因组数据鉴定了5个割手密种D27基因家族成员。系统进化树分析发现,割手密种D27s分处在3个不同系统发育分支,与高粱D27s高度同源。保守结构域预测揭示,割手密种D27s包含β-胡萝卜素异构酶的典型结构域Pfam:DUF4033。顺式元件分析结果显示,割手密种D27s主要参与调控激素和胁迫响应,以及植物生长发育等。基于甘蔗栽培种转录组数据分析发现,甘蔗割手密种D27基因家族成员(Sspon.06G0012830-1A)的同源基因同时参与甘蔗分蘖调控及黑穗病菌胁迫响应。在此基础上,我们克隆获得了甘蔗栽培种ROC22中的同源基因cDNA序列,命名为ScD27.1 (GenBank登录号为MT499895)。生物信息学分析结果显示, ScD27.1编码266个氨基酸,其蛋白等电点为8.91,分子量为30.00 kD,是不稳定蛋白且定位于叶绿体。二级结构主要包括α-螺旋和无规则卷曲,具有叶绿体转运肽,包含4个泛素化位点和18个磷酸化位点。qRT-PCR表达分析表明,ScD27.1基因受ABA及H2O2显著诱导表达,但对MeJA、SA胁迫响应不明显。亚细胞定位结果显示, ScD27.1蛋白可能定位于细胞膜和叶绿体,参与细胞内膜泡运输或由液泡前体、胞内运输小泡分拣运输。以上研究表明, ScD27.1基因可能参与黑穗病菌侵染诱导的甘蔗分蘖及ABA和H2O2相关信号通路。本研究为了解甘蔗ScD27.1蛋白在胞内运输和分蘖中的作用及其参与甘蔗-黑穗病菌互作提供一定的基础理论。     

金花茶查尔酮异构酶基因全长克隆与表达的初步研究

利用RT-PCR和RACE技术,从我国珍稀濒危植物金花茶花瓣中获得了查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因的cDNA全长,命名为Cn-CHI,GenBank登录号HQ269805.1。碱基序列分析表明,Cn-CHI基因全长953 bp,包含56 bp的5’非翻译区、204 bp的3’ 非翻译区和一个长为693 bp编码230个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列比对分析表明,Cn-CHI基因编码蛋白与蔷薇科、杜鹃花科、茄科等植物的CHI蛋白同源性都在75%以上,与山茶科山茶属茶树CHI蛋白同源性高达99%。相对荧光定量PCR分析表明,Cn-CHI基因在金花茶花蕾发育过程中呈现先急剧上升后平缓下降的趋势;在花器官的不同部位中,Cn-CHI基因表达量最高的是雌蕊,其次是雄蕊,在萼片和花瓣中的表达量较低且相差不大。