紫花苜蓿肽基脯氨酰顺反异构酶基因全长cDNA的电子克隆及同源建模

[目的]研究对紫花苜蓿肽基脯氨酰顺反异构酶基因全长cDNA进行电子克隆及同源建模的方法。[方法]根据物种间同源基因相对保守的特点,利用NCBI数据库,对公共EST数据库进行同源检索筛选和重叠群装配,获得拼接cDNA序列,经过ORFFinder分析后获得相应蛋白质的全长序列,并利用Swiss-Mode服务器预测各原子坐标,进而利用Swiss-PdbViewer生成三维空间模型。[结果]采用该方法成功获得紫花苜蓿肽基脯氨酰顺反异构酶基因的完整cDNA序列,全长为1880bp,mPPI蛋白质编码68AA,分子量约为7829.9Da,理论等电点pI=8.99,原子组成为C338H547N103O103S4,摩尔消光系数280nm处为4595,不稳定系数为42.16,脂肪系数为83.24,总平均亲水性为-0.456。[结论]根据物种间同源基因序列对跨物种间EST数据库进行同源检索筛选和拼接,是基因克隆的一条有效途径。     

短乳杆菌产葡萄糖异构酶培养基的响应面法优化

【目的】优化产葡萄糖异构酶短乳杆菌(Lactobacillus brevis)培养基,提高短乳杆菌产葡萄糖异构酶的能力。【方法】采用基于非完全平衡块原理的Plackett-Burman法和响应面法(Response Surface Methodology,RSM),对短乳杆菌发酵产葡萄糖异构酶的培养基进行优化。【结果】①短乳杆菌产葡萄糖异构酶的3个主要影响因子为:木糖、玉米浆干粉和MgSO4.7H2O。②通过最陡爬坡试验、旋转中心组合设计及响应面分析确定的短乳杆菌最适发酵培养基组成为:木糖13.43 g/L、玉米浆干粉23.14 g/L、MgSO4.7H2O 2.54 g/L、MnSO4.4H2O 0.25g/L、酵母膏5 g/L、醋酸钠5 g/L、柠檬酸三铵2 g/L、K2HPO42 g/L、Tween-80 1 mL/Lp、H 6.2~6.4。【结论】获得了能够提高短乳杆菌产葡萄糖异构酶能力的培养基,在优化培养基的条件下,葡萄糖异构酶总活力达到80.5 U,较优化前的60.5 U提高了33.06%。     

大麦蛋白质二硫键异构酶基因家族的鉴定与表达分析

蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerases,PDIs)是定位于真核生物内质网中的一类蛋白,具有催化蛋白质二硫键氧化还原反应与协助蛋白质发生构型变化、类似分子伴侣的功能,参与生长发育、生物或非生物胁迫应答等方面的调控。真核生物中PDI基因家族的分子鉴定已有报道,但是对大麦PDI基因家族的鉴定分析鲜有报道。本研究利用生物信息学分析手段鉴定了10个大麦PDI-Like基因(HvPDILs),并分析了相应编码蛋白的结构特征。与其他物种PDILs的系统发育分析发现,10个大麦PDILs分处在8个不同的系统分支,与小麦PDILs高度同源。对公共数据库中的组织和时空表达数据分析发现, HvPDILs基因均表达,且具组织和时空表达特异性。对接种大麦温性花叶病毒(BaMMV)之后的叶片样品进行基因表达水平分析,发现其中5个HvPDILs基因出现显著的表达差异,说明其参与病毒感染过程,但参与方式及作用机制还有待后续研究。     

油果实中查尔酮合成酶基因PsCHS的克隆表达分析及其启动子的分离

从成熟果实均一化全长cDNA文库中分离了编码CHS基因的全长cDNA序列,命名为PsCHS,根据其序列设计引物,采用Genome Walking方法从基因组DNA中分离获得PsCHS基因上游的调控序列,命名为PsCHSp,PsCHS基因全长1 442bp,其中ORF 1 176bp,编码392个氨基酸;采用APA-Walking技术,获得该基因的5ˊ端调控区,经在线软件预测,启动子序列含有典型的结构特征元件TATA-box和CAAT-box,还包含光响应元件、厌氧诱导元件、胚乳表达相关元件、MYB结合位点以及激素响应元件;RT-PCR结果显示,PsCHS基因在果实发育的前期表达量较高,花后40d表达量最高,随后开始下降,果实成熟期表达量较低。分离获得的PsCHS基因属于查尔酮合成酶基因家族成员之一,查尔酮合成酶(Chalcone synthase,CHS,EC 2.3.1.74)是类黄酮合成途径中的一个重要酶,该基因可能对类黄酮的合成起到调控作用。     

红麻查尔酮合成酶及其异构酶基因的克隆与表达分析

[目的]克隆红麻查尔酮合成酶(CHS)及其异构酶(CHI)基因并构建CH基因的植物表达载体,为进一步研究其在红麻育性及抗逆性中的作用奠定基础.[方法]提取红麻不育系(P3A)、保持系(P3B)花药RNA和DNA,以红麻花药转录组高通量测序数据为基础,利用同源克隆技术获得CHS和CHI基因,并利用载体重组技术构建CHS基因植物表达载体.[结果]红麻CHS基因cDNA全长序列为1236 bp,包含一个1170bp开放阅读框,编码389个氨基酸;其DNA序列全长为1329bp,包含2个外显子和1个内含子.CHI基因cDNA序列为724 bp,最大开放阅读框为630bp,编码209个氨基酸;其DNA序列全长为1087 bp,包含4个外显子和3个内含子.[结论]成功克隆获得红麻CHS和CHI基因的序列,构建的CHS基因植物表达载体pBI121-CHS可用于该基因功能的研究.     

半滑舌鳎酪氨酸酶基因(TYR)和多巴色素异构酶基因(DCT)的克隆表达与分析

作为我国鲆鳎鱼类中的一种主要养殖品种,半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)有时会发生无眼侧黑化(Melanism)、有眼侧白化(Albinism)的体色异常现象。本研究克隆了半滑舌鳎体色相关的酪氨酸酶基因(TYR)和多巴色素异构酶基因(DCT)的cDNA序列,并对这2个基因进行系统发育分析和时空表达分析。实验获得了TYR基因编码区cDNA序列长度为1620 bp,编码539个氨基酸;DCT基因编码区cDNA序列长度为1551 bp,编码516个氨基酸。结果显示,TYR和DCT在20日龄前的鱼苗体内表达量较高,尤其是在变态关键时期(15~20日龄)表达量最高,30日龄时的表达量锐减到很低水平;在其他时期的皮肤组织中,这2个基因在有眼侧正常皮肤和无眼侧黑化皮肤的表达量最高,在有眼侧白化皮肤和无眼侧正常皮肤中表达量极低;在其他时期的其他组织中,在眼睛中的表达量最高,其次是肝脏,在脾脏和肌肉中表达量极低。研究表明,TYR和DCT基因是半滑舌鳎无眼侧黑化发生和有眼侧体色维持的关键基因。本研究为查明半滑舌鳎体色异常机制提供了重要依据和参考。     

基因枪介导转hpa99基因小麦的获得和检测

为了探究来源于水稻细条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)的hpa99基因改良小麦抗赤霉病的可行性,以小麦幼胚诱导的愈伤组织为转化受体,以磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase,PMI)作为选择标记,通过基因枪法将带有hpa99基因的表达质粒AF234296导入普通小麦品种山农15。2～3次PMI筛选后,获得38株再生植株。通过氯酚红(chlorophenol red,CPR)染色以及PMI基因和目的基因hpa99的PCR检测,获得7株阳性植株,转化率为0.108%。结果表明,hpa99已整合到小麦基因组中,获得了无抗生素标记基因的转基因小麦。     

金花茶查尔酮异构酶基因全长克隆与表达的初步研究

利用RT-PCR和RACE技术,从我国珍稀濒危植物金花茶花瓣中获得了查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因的cDNA全长,命名为Cn-CHI,GenBank登录号HQ269805.1。碱基序列分析表明,Cn-CHI基因全长953 bp,包含56 bp的5’非翻译区、204 bp的3’ 非翻译区和一个长为693 bp编码230个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列比对分析表明,Cn-CHI基因编码蛋白与蔷薇科、杜鹃花科、茄科等植物的CHI蛋白同源性都在75%以上,与山茶科山茶属茶树CHI蛋白同源性高达99%。相对荧光定量PCR分析表明,Cn-CHI基因在金花茶花蕾发育过程中呈现先急剧上升后平缓下降的趋势;在花器官的不同部位中,Cn-CHI基因表达量最高的是雌蕊,其次是雄蕊,在萼片和花瓣中的表达量较低且相差不大。     

甘草查尔酮A对LPS诱导的奶牛蹄真皮细胞炎性反应的抑制作用

采用10,50,100 mg/L甘草查尔酮A处理蹄真皮炎性细胞24 h后,测定细胞上清液中TNF-a、IL-1β、IL-6水平及SOD、MDA含量,Western blot法检测ERK、JNK、p38、IκBα及p65蛋白表达水平.结果 显示,甘草查尔酮A可显著降低TNF-a、IL-1β、IL-6水平,提高SOD活性并...