受精液中添加β-ME、BSA和咖啡因对猪卵母细胞体外受精后早期发育的影响

进行受精液中添加不同浓度的β-ME、BSA和咖啡因对猪卵母细胞体外受精及其早期发育的影响试验。结果表明,在受精液中添加β-ME(2、10、50μmol/L)对猪卵母细胞体外受精后的早期发育无显著促进作用,当添加浓度过高(250μmol/L)时对早期胚胎发育反而不利;在受精液中添加咖啡因(1、2、4mmol/L)对猪卵母细胞体外受精后的早期发育无显著的促进作用;在受精液中添加BSA(0.1%、0.2%、0.4%、0.8%)对猪卵母细胞体外受精后的早期发育有一定的促进作用,并以添加0.4%BSA的效果最好。     

小鼠卵母细胞和早期胚胎端粒酶活性的测定

为了解小鼠早期发育过程中端粒酶的活性变化,本研究利用端粒重复序列扩增法(TRAP)进行了小鼠卵母细胞和附植前胚胎端粒酶活性的测定。结果表明,小鼠卵母细胞、桑椹胚和囊胚为端粒酶阳性,而2-细胞和8-细胞为阴性。依据电泳条带在成像系统下的光密度,计算相对总产品产量(TPG)的定量比较发现,囊胚端粒酶活性最高,为269.331;桑椹胚次之,为96.231;卵母细胞最低,为85.782。小鼠桑椹胚和囊胚胚胎记数及单细胞端粒酶活性比较结果显示,囊胚单细胞TPG最低,为3.45;桑椹胚单细胞略高于囊胚,为4.00;而卵母细胞最高,为85.782,大约是囊胚细胞的25倍。     

胞壁酰二肽对体外奶牛乳腺上皮细胞生长及胞内NOD2 mRNA表达的影响

【目的】奶牛乳房炎是奶牛养殖业中最为常见,同时也是带来经济损失最为严重的疾病之一,其主要病因是细菌感染。奶牛乳腺的固有免疫是抵抗病原菌入侵的第一道防线。NOD2是机体固有免疫模式识别受体核苷酸结合寡聚域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)蛋白家族中的重要一员,通过识别其特异性配体胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)——一种广泛存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁中的成分,而参与抵抗多种病原菌入侵。奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)除泌乳以外,还是奶牛乳腺的免疫屏障。本试验欲探究MDP对BMEC体外生长状态及胞内NOD2表达量的影响。【方法】选取健康泌乳中期荷斯坦奶牛乳腺腺泡为组织原材料,采用胶原酶Ⅰ消化法结合梯度浓度胰蛋白酶纯化法分离BMEC;使用上皮细胞特异性表达的角蛋白-18(cytokeratin-18,CK-18)及成纤维细胞特异性表达的波形蛋白(Vimentin)抗体,通过免疫荧光技术对纯化后获得的细胞进行鉴定;将BMEC设为6个处理组,分别添加浓度为0(空白对照组)、1、5、10、15及20μg·mL~(-1)的MDP,24 h后显微镜下观察细胞状态,同时提取细胞RNA并反转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR方法检测BMEC中NOD2的表达量。【结果】(1)胶原酶Ⅰ消化法结合梯度浓度胰蛋白酶纯化法分离得到的细胞CK-18免疫荧光结果为阳性,而Vimentin反应为阴性;细胞生长状态良好。(2)空白对照组、1、5及10μg·mL~(-1) MDP刺激组的BMEC生长状态良好,无任何肉眼可见变化;15μg·mL~(-1) MDP刺激组可见少量的BMEC脱落;而20μg·mL~(-1)MDP刺激组可见大量BMEC脱落,漂浮,且即使仍贴壁的细胞,其形态也发生了变化。(3)与空白对照组相比,各刺激组细胞NOD2 mRNA的表达量与MDP的刺激浓度呈正相关,即刺激时间为24 h时,随着MDP浓度的增加,BMEC中NOD2受体mRNA的表达量逐渐增加(P0.05)。【结论】成功获得了纯度较好的BMEC,该细胞生长状态良好,可以用于后续试验;虽然BMEC中NOD2受体mRNA的表达量与MDP的刺激浓度呈正相关,但在保持BMEC生长状态正常的前提下,MDP体外刺激浓度应控制在10μg·mL~(-1)以下。这些结果提示我们:当病原菌入侵乳腺时,BMEC可以通过NOD2受体途径参与免疫防御反应,但这种防御能力受细菌数量或毒力强度的影响。即在一定的细菌数量或毒力范围内,随着细菌数量的增加或毒力的增强,奶牛乳腺的免疫防御反应也增强,进而清除外来病原菌;而当细菌数量或毒力强度超过一定范围时,乳腺组织受到严重损伤,免疫防御屏障也随之崩溃,奶牛乳腺局部甚至全身将呈现出明显的临床症状。     

甘胆口服液对BRD犊牛血清急性期蛋白和氧化应激指标的影响

【目的】探讨甘胆口服液按推荐剂量用药对牛呼吸道疾病（bovine respiratory disease,BRD）的治疗效果及对血清急性期蛋白（acute phase protein,APP）浓度和氧化应激指标的影响,为其在牛临床上的推广应用提供依据。【方法】选择40头自然发病的BRD犊牛,随机分成2组,分别为受试药物组（甘胆口服液0.2 mL/kg）、对照药物组（麻杏石甘散0.75 g/kg）,并增加健康犊牛12头作为空白对照组,按推荐剂量1次/d,连用7 d,分别于试验第0,3,5,7天记录犊牛的一般临床症状,并依据BRD评分表进行打分;在试验第0,7天随机抽取各试验组犊牛12头颈静脉采血,测定血清APP（结合珠蛋白（HP）、淀粉样蛋白A（SAA）、C-反应蛋白（CRP））浓度和氧化应激指标（丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC））水平。【结果】药物组试验犊牛第0天证候积分均≥5分,符合试验要求。用药第3,5,7天临床症状积分均不同程度降低（P<0.05）。在第5天时积分均<5分,第7天积分减少到最小值。麻杏石甘散组犊牛在第3天时的BRD治愈率高于甘胆口服液组（P>0.05）,但随着治疗时间的延长,甘胆口服液治愈率与麻杏石甘散相近,用药5 d后,两药物组治愈率均达到60%以上。BRD组犊牛第0天血清HP、SAA、MDA水平显著高于健康对照组（P<0.05）,GSH、T-AOC水平及SOD、CAT活性均不同程度低于健康对照组,但差异不显著（P>0.05）。经过药物治疗后,BRD组犊牛第7天血清HP、SAA、MDA水平显著下降,GSH水平和SOD活性显著上升（P<0.05）。【结论】甘胆口服液能明显改善BRD犊牛临床症状,有效缓解患BRD犊牛氧化应激状态,降低血清急性期蛋白水平。联合应用急性期蛋白和氧化应激指标可以对BRD犊牛进行早期诊断及疗效监测。     

牛体外受精卵的二步法培养体系的研究

以CR1aa为基础培养液,采用二步法对牛体外受精卵进行体外培养,完善牛体外受精卵的培养体系.实验一:对照组连续7 d均为CR1aa 50 mL/L FBS培养,处理组前3 d为CR1aa 3 mg/mLBSA培养,后4 d换为CR1aa 50 mL/L FBS.处理组的囊胚率显著高于对照组,但卵裂率和囊胚孵化率无显著差异.实验二:对照组连续7 d均为CR1aa 50 mL/L FBS培养,处理组前3 d为CR1aa培养,后4 d换为CR1aa 50 mL/L FBS.处理组的卵裂率显著高于对照组,但囊胚率和囊胚孵化率差异不显著.实验三:对照组连续7 d均为CR1aa 50 mL/L FBS 0.1mmol/L GSH培养,处理组前3 d为CR1aa 0.1 mmol/L GSH培养,后4 d换为CR1aa 50 mL/L FBS 0.1 mmol/L GSH.处理组的卵裂率显著高于对照组,囊胚率极显著高于对照组,但囊胚孵化率差异不显著.结果表明,GSH与二步法培养系统结合相对于传统的一步法培养系统更适于牛体外受精卵的体外培养.     

激素对奶牛乳腺上皮细胞乳脂肪合成的调控作用

乳脂肪是高质量的天然脂肪,其可为人类提供营养和能量,在各种膳食脂肪和油类中,是最容易被消化吸收的。乳脂肪是在乳腺中由从头合成或外源摄取的脂肪酸与甘油酯化形成的一种脂类物质,其含量的高低关系着牛奶品质的优劣和乳制品的加工特性。在奶牛的泌乳周期中,乳腺泌乳功能受多种因素影响,其中内分泌腺分泌的多种激素对奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）乳脂的合成具有积极的调控作用。综上所述,作者介绍了氢化可的松、催乳素、胰岛素和生长激素4种泌乳相关激素对BMECs乳脂肪合成的调控机理,即从乳脂合成适宜的激素添加量、激素对乳脂球形态的影响方面初步阐释其调控作用,并从乳脂合成的关键酶及转录因子、激素对乳脂合成相关基因表达量方面深入阐释其作用机理,旨在为研究泌乳相关激素对奶牛乳腺内乳脂肪合成的调控机理提供参考。     

前列腺素E2和F2α对LPS刺激后奶牛子宫内膜上皮细胞COX-1和COX-2表达的影响

试验旨在阐明前列腺素E₂（prostaglandin E₂,PGE₂）和F_2α（prostaglandin F_2α,PGF_2α）对体外培养的奶牛子宫内膜上皮细胞中环氧合酶-1（cyclooxygenase-1,COX-1））与环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）表达的影响。培养奶牛子宫内膜上皮原代细胞和传代细胞,第4代细胞以1×10⁶个/孔接种于6孔板,以10^-7mol/L PGE₂和PGF_2α分别预处理细胞24 h,以100 ng/mL细菌脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）刺激细胞4、8和12 h后分别提取RNA和总蛋白质,采用实时荧光定量PCR与Western blotting等技术检测COX-1与COX-2 mRNA和蛋白质的表达量。结果表明,与对照组相比,COX-1 mRNA表达量在PGE₂单独作用4、8和12 h后显著上调（P<0.05）;COX-2 mRNA表达量在PGE₂单独作用4和12 h后显著上调（P<0.05）,PGE₂单独处理使COX-1、COX-2蛋白表达量均显著上调（P<0.05）。与对照组相比,LPS刺激8和12 h时COX-1 mRNA表达量显著下调（P<0.05）,LPS刺激后COX-1蛋白表达量无显著变化（P>0.05）;LPS刺激后4、8和12 h时COX-2 mRNA表达量显著上调（P<0.05）,LPS刺激后COX-2蛋白表达量显著上调（P<0.05）。与LPS单独处理组相比,LPS+PGE₂处理组在8和12 h时COX-1和COX-2 mRNA表达量均显著上调（P<0.05）,同时COX-1和COX-2蛋白表达量也显著上调（P<0.05）。PGF_2α在LPS未刺激和刺激后对COX-1和COX-2 mRNA的表达无显著影响（P>0.05）,仅在PGF_2α单独处理8和12 h后COX-1 mRNA表达量上调（P<0.05）。两种激素联合处理与各自单独处理及LPS单独刺激相比,对COX-1和COX-2 mRNA表达具有一定的协同诱导作用。     

奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态观察

利用原代培养后纯化的奶牛乳腺上皮细胞,以Matrigel为基质胶原,进行奶牛乳腺上皮细胞的三维培养,细胞接种浓度分别为1×104、1×105和1×106个细胞/mL。经过16d培养后,用DAPI对细胞染色,利用荧光显微镜观察细胞生长状况。结果表明,当细胞接种浓度为1×104～1×105个细胞/mL时,细胞形成了团块状结构,出现了类似腔状的腺泡形态。     

COMPARATIVE EVALUATION OF HYDROPIC DEGENERATION OF THE LIVER IN DAIRY CATTLE THROUGH BIOCHEMISTRY, ULTRASONOGRAPHY AND DIGITAL ANALYSIS

Ultrasonography of the liver of 181 Holstein-Friesian cows was performed and blood samples were collected for analysis. The hepatic ultrasonograms were evaluated and the echoes were analyzed digitally. After slaughter, liver specimens were taken and examined histopathologically. Of the 181 animals, 120 had a normal liver and 61 had hydropic degeneration of the liver, diagnosed through histopathologic examination. Diagnostic accuracy rates for hydropic degeneration were determined based on the following test positive conditions: a) for biochemical analysis—high levels of aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, total bilirubin and non-esterified fatty acids; b) for ultrasonography—presence of dark pattern and blurring of edges; and c) for digital analysis—low echo means at 1 cm and 3 cm from the hepatic surface. Digital analysis had the highest overall specificity, accuracy and positive predictive values for hydropic degeneration, followed by ultrasonography. The results suggest that ultrasonography and digital analysis of hepatic ultrasonograms can be used for diagnosis of hydropic degeneration of the liver in place of biochemical analysis.     

The effects analysis of two neonicotinoid insecticides on in vitro maturation of porcine oocytes using hanging drop monoculture method

Acetamiprid (ACE) and imidacroprid (IMI) are known neonicotinoid insecticides with strong affinities for the insect-selective nicotinic acetylcholine receptor. These provide insect control by hyperstimulating insect nerves and are used for agricultural pest management. However, it has also been reported that ACE and IMI affect mammalian reproductive function. We determined the effects of ACE and IMI on the in vitro maturation of porcine oocytes. Significant decreases in nuclear maturation rates were observed in the ACE or IMI-exposed groups. Also, in matured oocytes from the ACE or IMI-exposed groups, irregular chromosomes were observed. Our results suggest that ACE and IMI exposure was detrimental to porcine oocytes and the extent of the effects depends on the concentration of exposure.