猪链球菌2型江苏分离株溶血素基因的检测及序列分析

根据猪链球菌2型(strep tococcus su is type 2)溶血素基因(sly)设计和合成了一对可扩增其完整阅读框的引物,对HA 9801等6株猪链球菌2型江苏分离株、1株德国分离株SS2-D及猪链球菌C群参考株ATCC 35246的核酸进行PCR扩增,结果显示HA 9801等6株江苏分离株及德国株SS2呈阳性,ATCC 35246呈阴性。HA 9801株PCR产物纯化后测序,序列分析结果表明该DNA片段与猪链球菌2型1933株的sly基因同源性为99%。     

一株野鸟源H9N2亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及致病性研究

为进一步了解2014年分离自我国南方野鸟粪便中的一株H9N2亚型禽流感病毒(AIV)Wide Bird/Hu N/SC1400/2014(H9N2)(WB/400/14)的生物学特性,本研究对其进行全基因组序列测定、进化分析及SPF鸡、SPF鸭和BALB/c小鼠的感染性试验。序列分析显示:该分离株的HA裂解位点基序为333PAASDR↓GL340,其中不存在多个连续的碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒(LPAIV)氨基酸序列特征。该分离株不同基因片段来源较复杂,分别与H9、H6、H4、H1、H11、H10、H3等多种亚型的LPAIV同源性较高,呈现明显的多样性。感染性试验显示,WB/400/14不能够在SPF鸡和小鼠体内有效复制,但病毒感染SPF鸭后能够在部分脏器中检测到病毒的存在,并且感染鸭能通够过咽喉和泄殖腔同时向外排毒,而同居感染鸭仅通过泄殖腔向外排毒,表明分离株在SPF鸭群中具有良好的水平传播能力。本研究为AIV的监测和防控提供实验依据。     

猪瘟病毒E2蛋白在酵母中分泌表达条件的优化

影响外源基因在毕赤酵母中表达的因素很多，除了基因序列本身的内在特性外，表达条件对外源基因的表达量的高低也有着极显著的影响。本文对猪瘟病毒E2基因在毕赤酵母中不同的时间、不同的诱导型、不同的pH、不同的诱导剂量等方面表达量的差异进行了详细对比研究。结果表明，诱导后72～96h，重组E2蛋白的表达量最高。与单纯甲醇诱导相比，甘油／甲醇诱导后的表达量明显提高。在pH7．5和pH8．0表达E2蛋白是比较合适的。甲醇浓度在3％左右时E2蛋白的表达量较高。     

新孢子虫dNcSRS2重组蛋白间接ELISA的建立及其应用

利用新孢子虫体外重组表面蛋白dNcSRS2蛋白作为包被抗原，对各项条件进行优化，确定判定标准，建立了检测新孢子虫血清抗体的间接ELISA方法。经对多例血清检测表明，所建立的诊断试剂盒重复性好、特异性强、灵敏度高，与进口的IFAT及两种商品化ELISA试剂盒的检测结果相比较，符合率均达到92％以上。应用建立的ELISA方法对236份奶牛血清的新孢子虫抗体进行检测，阳性率为22％。这是国内首次利用重组蛋白建立的诊断试剂盒，该方法的建立将为牛新孢子虫病的诊断与流行病学调查提供有效的技术手段。     

密码子优化型鹅细小病毒病毒样颗粒的表达与鉴定

根据昆虫细胞密码子的偏嗜性,对鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)VP2基因的密码子进行优化,利用Bac-to-Bac表达系统构建了表达优化VP2基因的重组杆状病毒,通过感染昆虫细胞(Sf9)获得病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)。SDS-PAGE分析显示Sf9细胞中出现了65 kDa的蛋白条带,间接免疫荧光(indirect immunofluorescent assay,IFA)和Western blot结果均证实表达产物能与鼠抗GPV VP2抗体发生特异性反应,说明其具有良好的免疫反应性。同时,试验结果还证明,密码子优化后的GPV VP2基因在昆虫细胞中表达量得到了提高,明显高于野生型VP2基因。透射电镜观察纯化后的昆虫细胞表达产物,可见直径约30 nm的VLPs,表明密码子的优化并不影响VP2蛋白的组装。本研究为进一步研制诊断抗原以及新型GPV疫苗等奠定了基础。     

H3N2亚型猪流感病毒HA和HA1蛋白的原核表达

为原核表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的HA和HA1蛋白,通过RT-PCR方法获得SIV的HA和HA1基因,克隆至原核表达载体pMAL-c5X,并转化至原核表达菌Rosetta(DE3)中,表达菌经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示,成功表达了H3亚型SIV的HA和HA1蛋白,目的蛋白均以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,并与H3N2亚型SIV的HA单克隆抗体反应,说明HA和HA1蛋白具有良好的反应原性。     

猪2型圆环病毒核酸疫苗免疫效应研究

PCR扩增PCV2 ORF2和BVP22基因。将ORF2基因克隆入真核表达载体pCDNA3．1（＋），构建了pCORF2作为核酸疫苗免疫小白鼠。同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游，使二者融合表达，命名为pCORF2BVP22和pCBVP220RF2。分4组肌肉免疫BALB/c小白鼠，分别注射pCDNA3．1（＋）、pCORF2、pCORF2BVP22和pCBVP220RF2，共免疫2次，间隔2周，分别于首免后2周和二免后4周采血，ELISA法检测体液抗体。同时为在体外验证ORF2和BVP22基因的真核表达，将ORF2和BVP22基因分别克隆入pEGFP-N1载体，构建了pNORF2和pNBVP22，转染Hela细胞后在荧光显微镜下观察到了ORF2和BVP22在体外的瞬时高效表达。结果显示，通过两次免疫后，各疫苗组均产生了针对ORF2的体液抗体，同时证明BVP22可增强核酸疫苗的免疫效果，其中以BVP22在ORF2上游效果更好。本研究为防制猪2型圆环病毒感染提供了较为理想的侯选疫苗。     

多药耐药相关蛋白2在健康和大肠杆菌感染SD大鼠肝脏和肠组织中的定位及mRNA表达水平

本研究旨在探讨多药耐药相关蛋白2(MRP2)在健康和感染大肠杆菌的SD大鼠肝脏、十二指肠、空肠、回肠和结肠中的分布特点和mRNA表达水平.选用健康成年SD大鼠20只,随机分成健康对照组和大肠杆菌感染组,采用免疫组织化学和荧光定量PCR的方法检测了MRP2在大鼠肝脏和肠组织中的定位与表达.结果显示:MRP2在健康和感染大鼠不同组织中均有分布,主要见于肝脏的胆管面(肝脏毛细胆管的细胞膜)、肝脏门静脉区和各肠段的肠黏膜层,但蛋白表达水平不同.健康组大鼠MRP2在肝脏毛细胆管的细胞膜分布比门静脉区附近广泛,在肝脏毛细胆管的细胞膜和门 静脉区表达均为强阳性;在十二指肠和空肠的表达为强阳性,在回肠和结肠表达为阳性;与健康组相比,MRP2在感染组大鼠的蛋白表达水平均较弱,主要表现为十二指肠和空肠为阳性,回肠和结肠中为弱阳性,肝细胞的胆管面为阳性,肝脏门静脉区附近呈弱阳性.MRP2的mRNA在健康和大肠杆菌感染大鼠的肝脏和肠组织中均有表达,但表达水平也存在差异.与健康组大鼠相比,MRP2 mRNA表达量在大肠杆菌感染组大鼠肝脏和小肠中显著下调(P＜0.05).SD大鼠感染大肠杆菌后可引起肝脏、小肠组织中MRP2在mRNA和蛋白水平的表达下调.     

2011年-2013年滨州及其周边地区4种猪病毒性疾病的流行情况分析

通过对滨州及其周边地区2011年-2013年316个场次采集病料进行猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒与猪圆环病毒2型的检测,并对检测结果进行了统计分析,了解滨州及其周边地区上述4种疫病的流行状况。     

血清2型猪链球菌河南分离株毒力基因的鉴定及其cps2j全基因序列分析

为了解血清2型猪链球菌(S.suis2)河南分离株的毒力基因型及cps2j全基因突变情况,本研究扩增S.suis2毒力基因gdh、cps2j、mrp、ef 、sly、orf2和fbps,并对s.suis2的cps2j进行全基因序列测定和同源性分析.结果表明,gdh、cps2j、mrp、ef、sly、orf2和fbps基因在8个S.suis2分离株中的检出率分别为100％(8/8)、100％(8/8)、62.5％(5/8)、75％(6/8)、87.5％(7/8)、100％(8/8)和100％(8/8);其中cps2j全基因核苷酸及推导的氨基酸序列与来源不同的S.suis2分离株同源性分别达98％和97％以上,以该基因构建的系统发育树表明8株S.suis2河南分离株与国内外不同参考株同源性高,亲缘关系密切.